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阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是多发于老年人的一种神经退行性疾病，患者症状为表现为进行性记忆障碍以及认知、语言和运动等多种功能衰退，这些症状进而发展为个性改变和行为异常，最终导致生活自理能力的丧失。AD的一个重要特征就是脑组织中的老年斑(senile plaque，SP)，而SP是由淀粉样蛋白β(amyloidβprotein，Aβ)组成的。Aβ是淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的级联酶切产物。Aβ及其聚集体可扰乱神经元的能量代谢和钙稳态，促进细胞活性氧的生成，阻碍神经信号的传递，并导致神经元死亡;可持续活化神经胶质细胞，引发慢性炎症;还会引起tau蛋白的结构变化和细胞骨架的降解。课题组在前期研究中对鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)进行过氧化氢降解，然后用超滤膜截留，获得平均分子量为3928Da的低分子量硫酸软骨素(low molecular weight chondroitin sulfate，LMWCS)。研究发现，该LMWCS可抑制Aβ引起的氧化应激，改善线粒体功能异常紊乱，进而抑制Aβ诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞的凋亡。而对侧脑室注射Aβ的AD模型小鼠，口服LMWCS能改善小鼠脑部的氧化应激，维持脑部能量代谢的稳定，改善脑部胆碱能功能，进而改善小鼠的相关行为学功能和指标。基于以上研究成果，本课题将采用5XFAD转基因小鼠评价LMWCS的抗AD活性，并进一步探究LMWCS对AD相关病理变化的影响。在此基础上，本课题将进一步探究CS寡糖的分子量与其抗AD活性和机制之间的关系，从而为LMWCS在抗AD药物应用上的研究提供指导。具体研究内容如下。
(1)LMWCS对5XFAD转基因小鼠认知功能损伤的作用与机制研究
采用前期研究中使用的LMWCS对2月龄的5XFAD转基因小鼠进行灌胃给药，设定低、中、高3个剂量组，分别为50mg/kg、150mg/kg和450mg/kg，连续给药3个月。采用Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)试验和旷场试验(open field test，OFT)评价小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力等行为学相关的指标。随后取小鼠的大脑，分离出海马和皮质，并提取各组织的蛋白。采用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法测定小鼠海马中Aβ1-42含量，并采用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定小鼠海马和皮质中的APP及与APP酶切相关的酶PS1(presenilin 1)、BACE1(β-siteAPPcleavingenzyme1)和ADAM10(a disintegrin and metalloproteinase family 10)的表达。采用ELISA法测定小鼠海马中IL-1β(interleukin-1β)、TNF-α(tumornecrosisfactorα)和IL-6含量，并采用Westernblot测定小鼠海马和皮质中与炎症相关的GFAP(glial fibrillary acidic protein)、TLR2(toll-like receptor 2)和pERK1/2(phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2)的表达。利用生色底物法测定具有还原性的谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量;利用生色底物法测定GSH-Px(glutathione peroxidase)的活性;利用MDA(malondialdehyde)和TBA(thiobarbituric acid)的显色反应测定小鼠海马中MDA含量;利用氮蓝四唑显色法测定总SOD(superoxide dismutase)活性;，并用Westernblott检测小鼠海马和皮质中SOD2的表达。采用Westernblot检测phospho-tau(Ser404)的表达，以及与Tau蛋白磷酸化有关的酶phospho-GSK3β(phospho-glycogensynthasekinase3β)、CDK5(cyclin-dependent kinase 5)、p35和p25的表达。
结果表明，在MWM试验中，服用LMWCS的5XFAD小鼠，潜伏期有一定程度的缩短，穿过平台和目标象限的次数有一定的增加，在目标象限的路程和时间也有一定的延长;而在OFT中，LMWCS对5XFAD小鼠穿过中心区域的路程和总路程均有一定的提高。总的来说，LMWCS对5XFAD小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力均有一定的改善。LMWCS使5XFAD小鼠海马和皮质中APP和PS1的表达显著下降，对ADAM10和BACE1的表达也有一定的抑制作用，使5XFAD小鼠大脑中Aβ1-42含量显著下降，减少Aβ1-42的神经毒性。LMWCS显著降低5XFAD小鼠海马和皮质中GFAP和TLR2的表达，并降低5XFAD小鼠大脑中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。这表明LMWCS通过阻碍炎症通路的激活而抑制免疫细胞的活化，减少5XFAD小鼠大脑中促炎因子的释放，达到抑制5XFAD小鼠脑部神经炎症的效果。LMWCS使5XFAD小鼠大脑内抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性不同程度地升高，从而使MDA显著下降，GSH显著升高，改善了5XFAD小鼠脑部的氧化应激状态。LMWCS显著抑制了5XFAD小鼠海马中Tau蛋白的过磷酸化，这可能是由于LMWCS对引起Tau蛋白过磷酸化的酶有一定的调控作用。综上所述，LMWCS对5XFAD小鼠脑部的Aβ分泌、神经炎症、氧化应激和Tau蛋白过磷酸化均有抑制作用，从而改善5XFAD小鼠的空间学习、空间记忆、好奇心、活跃度等多项行为学指标。
(2)不同分子量的CS寡糖的制备和表征
利用PCR技术从普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的基因组中克隆出硫酸软骨素酶ABCⅠ(ChondroitinaseABCⅠ，CHSaseABCⅠ)的基因序列。利用Gibson连接体系将该基因序列与大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)连接，构建重组质粒pET-28a(+)-CHSaseABCⅠ。将该重组质粒转入E.coliBL21进行表达。采用0.2mg/LIPTG、20℃诱导表达20h，表达出带有6×His标签的CHSaseABCⅠ(His-CHSaseABCⅠ)。利用Ni2+-Sepharose亲和层析柱对His-CHSaseABCⅠ进行分离纯化。对纯化后的His-CHSaseABCⅠ的酶学特性进行分析，确定反应条件。用His-CHSaseABCⅠ对鲨鱼软骨来源的CS进行酶解，经过Bio-gelP10和HPSEC(high performance liquid size exclusion chromatograph)对酶解产物进行的分离和纯化，获得CSDP2(disaccharide)、CSDP4(tetrasaccharide)、CSDP6(hexasaccharide)、CSDP8(octasaccharide)、CSDP10(decasaccharide, CS DP10)和CSDP12(dodecasaccharide)。对纯化后的CS寡糖进行HPSEC检测和ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry)检测。
结果表明，His-CHSaseABCⅠ对CS有较好的底物特异性，其对CS的比酶活可达到2600.7μmol/min·mg蛋白，而对透明质酸和肝素的比酶活则很低。His-CHSaseⅠ酶解CS的最适pH为7.5、最适温度为37℃、反应体系中NaCl浓度应小于0.5mol/L。为保证各CS寡糖产量，设定反应条件为，取双蒸水配制的CS溶液(80 mg/mL)1mL，加1个酶活单位的酶液，30℃反应10h。经过分离和纯化后，各CS寡糖的峰纯度均在95％以上。ESI-MS结果也表明各CS寡糖制备成功。
(3)CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能紊乱活性的关系研究
采用Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞作为模型评价CS寡糖对Aβ引起的氧化应激和线粒体损伤的影响。采用MTT法测定及Annexin-FITC/PI双染法测定SH-SY5Y细胞凋亡情况。针对氧化应激的变化，采用Griess试剂显色法测定细胞NO生成情况，采用DCFH-DA荧光法测定细胞ROS生成情况，采用前文所述方法测定细胞MDA含量;用前文所述方法测定细胞总SOD和GSH-Px酶活性的变化;Westernblot检测与氧化应激相关的酶的表达。针对SH-SY5Y细胞能量代谢的变化，采用荧光探针JC-1测定细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的变化，用相应试剂盒测定细胞Na+/K+-ATP酶活性的变化。针对SH-SY5Y细胞凋亡通路，用Westernblot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化。针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况，用AlexaFluor647succinimidylester对Aβ聚集体进行标记，然后与各CS寡糖进行共孵育，随后对细胞进行处理，采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的平均荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。
结果表明，对于Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞，CS寡糖可以抑制Aβ引起的凋亡，这一作用是通过抑制Aβ引起的氧化应激和线粒体功能异常紊乱实现的，且随着CS寡糖分子量的增加，抑制作用逐渐增强。这是由于CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止SH-SY5Y细胞对Aβ聚集体的摄取，因此在本课题所研究的不同分子量的CS寡糖中，CSDP12具有最强的抑制活性。
(4)CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的神经炎症活性的关系研究
采用Aβ损伤的BV2细胞模型评价CS寡糖对Aβ诱导的免疫细胞活化的影响。采用CCK-8法测定BV2细胞活力的变化。针对BV2细胞的活化情况，采用ELISA测定细胞IL-1β和TNF-α的含量;针对BV2细胞炎症通路的变化，用Westernblot测定TLR2和NF-κB表达的变化;针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况，用AlexaFluor647succinimidylester对Aβ聚集体进行标记，然后与各CS寡糖进行共孵育，随后对细胞进行处理，采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的MFI作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。
结果表明，对于Aβ孵育的BV2细胞，CS寡糖可以抑制Aβ对BV2细胞的活化，抑制促炎因子的生成和细胞内NF-κB的释放。随着CS寡糖分子量的增加，对Aβ诱导的对BV2细胞的炎症反应的抑制作用逐渐减小，CSDP2的抑制作用最强，这是由于不同分子量的CS寡糖阻碍了Aβ聚集体与TLR2的相互作用，而其中CSDP2的抑制作用最强。
综上所述，本课题采用5XFAD转基因小鼠作为模型，进一步验证了LMWCS的抗AD活性，并发现其抗AD活性与其调控APP酶切过程、抗炎和抗氧化活性密切相关。CS寡糖分子量与抗AD活性的关系研究表明，CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对Aβ聚集体的摄取，从而抑制Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能异常紊乱，最终抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的凋亡。且随着CS寡糖分子的延长，其抑制作用逐渐增强。而在CS寡糖的分子量与其抑制Aβ引起的神经炎症的关系的研究中，CS寡糖通过阻碍Aβ聚集体与TLR2的结合而抑制BV2细胞的活化，从而减少炎症因子的释放，而其中CSDP2具有最强的抑制作用。以上研究结果进一步证实了LMWCS的抗AD活性，并初步探究了基于不同机制，CS寡糖的分子量变化对其抗AD活性的影响，对于糖胺聚糖类药物的抗AD研究具有指导作用，为LMWCS作为抗AD药物的开发提供了依据。
(1)LMWCS对5XFAD转基因小鼠认知功能损伤的作用与机制研究
采用前期研究中使用的LMWCS对2月龄的5XFAD转基因小鼠进行灌胃给药，设定低、中、高3个剂量组，分别为50mg/kg、150mg/kg和450mg/kg，连续给药3个月。采用Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)试验和旷场试验(open field test，OFT)评价小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力等行为学相关的指标。随后取小鼠的大脑，分离出海马和皮质，并提取各组织的蛋白。采用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法测定小鼠海马中Aβ1-42含量，并采用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定小鼠海马和皮质中的APP及与APP酶切相关的酶PS1(presenilin 1)、BACE1(β-siteAPPcleavingenzyme1)和ADAM10(a disintegrin and metalloproteinase family 10)的表达。采用ELISA法测定小鼠海马中IL-1β(interleukin-1β)、TNF-α(tumornecrosisfactorα)和IL-6含量，并采用Westernblot测定小鼠海马和皮质中与炎症相关的GFAP(glial fibrillary acidic protein)、TLR2(toll-like receptor 2)和pERK1/2(phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2)的表达。利用生色底物法测定具有还原性的谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量;利用生色底物法测定GSH-Px(glutathione peroxidase)的活性;利用MDA(malondialdehyde)和TBA(thiobarbituric acid)的显色反应测定小鼠海马中MDA含量;利用氮蓝四唑显色法测定总SOD(superoxide dismutase)活性;，并用Westernblott检测小鼠海马和皮质中SOD2的表达。采用Westernblot检测phospho-tau(Ser404)的表达，以及与Tau蛋白磷酸化有关的酶phospho-GSK3β(phospho-glycogensynthasekinase3β)、CDK5(cyclin-dependent kinase 5)、p35和p25的表达。
结果表明，在MWM试验中，服用LMWCS的5XFAD小鼠，潜伏期有一定程度的缩短，穿过平台和目标象限的次数有一定的增加，在目标象限的路程和时间也有一定的延长;而在OFT中，LMWCS对5XFAD小鼠穿过中心区域的路程和总路程均有一定的提高。总的来说，LMWCS对5XFAD小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力均有一定的改善。LMWCS使5XFAD小鼠海马和皮质中APP和PS1的表达显著下降，对ADAM10和BACE1的表达也有一定的抑制作用，使5XFAD小鼠大脑中Aβ1-42含量显著下降，减少Aβ1-42的神经毒性。LMWCS显著降低5XFAD小鼠海马和皮质中GFAP和TLR2的表达，并降低5XFAD小鼠大脑中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。这表明LMWCS通过阻碍炎症通路的激活而抑制免疫细胞的活化，减少5XFAD小鼠大脑中促炎因子的释放，达到抑制5XFAD小鼠脑部神经炎症的效果。LMWCS使5XFAD小鼠大脑内抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性不同程度地升高，从而使MDA显著下降，GSH显著升高，改善了5XFAD小鼠脑部的氧化应激状态。LMWCS显著抑制了5XFAD小鼠海马中Tau蛋白的过磷酸化，这可能是由于LMWCS对引起Tau蛋白过磷酸化的酶有一定的调控作用。综上所述，LMWCS对5XFAD小鼠脑部的Aβ分泌、神经炎症、氧化应激和Tau蛋白过磷酸化均有抑制作用，从而改善5XFAD小鼠的空间学习、空间记忆、好奇心、活跃度等多项行为学指标。
(2)不同分子量的CS寡糖的制备和表征
利用PCR技术从普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的基因组中克隆出硫酸软骨素酶ABCⅠ(ChondroitinaseABCⅠ，CHSaseABCⅠ)的基因序列。利用Gibson连接体系将该基因序列与大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)连接，构建重组质粒pET-28a(+)-CHSaseABCⅠ。将该重组质粒转入E.coliBL21进行表达。采用0.2mg/LIPTG、20℃诱导表达20h，表达出带有6×His标签的CHSaseABCⅠ(His-CHSaseABCⅠ)。利用Ni2+-Sepharose亲和层析柱对His-CHSaseABCⅠ进行分离纯化。对纯化后的His-CHSaseABCⅠ的酶学特性进行分析，确定反应条件。用His-CHSaseABCⅠ对鲨鱼软骨来源的CS进行酶解，经过Bio-gelP10和HPSEC(high performance liquid size exclusion chromatograph)对酶解产物进行的分离和纯化，获得CSDP2(disaccharide)、CSDP4(tetrasaccharide)、CSDP6(hexasaccharide)、CSDP8(octasaccharide)、CSDP10(decasaccharide, CS DP10)和CSDP12(dodecasaccharide)。对纯化后的CS寡糖进行HPSEC检测和ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry)检测。
结果表明，His-CHSaseABCⅠ对CS有较好的底物特异性，其对CS的比酶活可达到2600.7μmol/min·mg蛋白，而对透明质酸和肝素的比酶活则很低。His-CHSaseⅠ酶解CS的最适pH为7.5、最适温度为37℃、反应体系中NaCl浓度应小于0.5mol/L。为保证各CS寡糖产量，设定反应条件为，取双蒸水配制的CS溶液(80 mg/mL)1mL，加1个酶活单位的酶液，30℃反应10h。经过分离和纯化后，各CS寡糖的峰纯度均在95％以上。ESI-MS结果也表明各CS寡糖制备成功。
(3)CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能紊乱活性的关系研究
采用Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞作为模型评价CS寡糖对Aβ引起的氧化应激和线粒体损伤的影响。采用MTT法测定及Annexin-FITC/PI双染法测定SH-SY5Y细胞凋亡情况。针对氧化应激的变化，采用Griess试剂显色法测定细胞NO生成情况，采用DCFH-DA荧光法测定细胞ROS生成情况，采用前文所述方法测定细胞MDA含量;用前文所述方法测定细胞总SOD和GSH-Px酶活性的变化;Westernblot检测与氧化应激相关的酶的表达。针对SH-SY5Y细胞能量代谢的变化，采用荧光探针JC-1测定细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的变化，用相应试剂盒测定细胞Na+/K+-ATP酶活性的变化。针对SH-SY5Y细胞凋亡通路，用Westernblot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化。针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况，用AlexaFluor647succinimidylester对Aβ聚集体进行标记，然后与各CS寡糖进行共孵育，随后对细胞进行处理，采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的平均荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。
结果表明，对于Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞，CS寡糖可以抑制Aβ引起的凋亡，这一作用是通过抑制Aβ引起的氧化应激和线粒体功能异常紊乱实现的，且随着CS寡糖分子量的增加，抑制作用逐渐增强。这是由于CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止SH-SY5Y细胞对Aβ聚集体的摄取，因此在本课题所研究的不同分子量的CS寡糖中，CSDP12具有最强的抑制活性。
(4)CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的神经炎症活性的关系研究
采用Aβ损伤的BV2细胞模型评价CS寡糖对Aβ诱导的免疫细胞活化的影响。采用CCK-8法测定BV2细胞活力的变化。针对BV2细胞的活化情况，采用ELISA测定细胞IL-1β和TNF-α的含量;针对BV2细胞炎症通路的变化，用Westernblot测定TLR2和NF-κB表达的变化;针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况，用AlexaFluor647succinimidylester对Aβ聚集体进行标记，然后与各CS寡糖进行共孵育，随后对细胞进行处理，采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的MFI作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。
结果表明，对于Aβ孵育的BV2细胞，CS寡糖可以抑制Aβ对BV2细胞的活化，抑制促炎因子的生成和细胞内NF-κB的释放。随着CS寡糖分子量的增加，对Aβ诱导的对BV2细胞的炎症反应的抑制作用逐渐减小，CSDP2的抑制作用最强，这是由于不同分子量的CS寡糖阻碍了Aβ聚集体与TLR2的相互作用，而其中CSDP2的抑制作用最强。
综上所述，本课题采用5XFAD转基因小鼠作为模型，进一步验证了LMWCS的抗AD活性，并发现其抗AD活性与其调控APP酶切过程、抗炎和抗氧化活性密切相关。CS寡糖分子量与抗AD活性的关系研究表明，CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对Aβ聚集体的摄取，从而抑制Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能异常紊乱，最终抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的凋亡。且随着CS寡糖分子的延长，其抑制作用逐渐增强。而在CS寡糖的分子量与其抑制Aβ引起的神经炎症的关系的研究中，CS寡糖通过阻碍Aβ聚集体与TLR2的结合而抑制BV2细胞的活化，从而减少炎症因子的释放，而其中CSDP2具有最强的抑制作用。以上研究结果进一步证实了LMWCS的抗AD活性，并初步探究了基于不同机制，CS寡糖的分子量变化对其抗AD活性的影响，对于糖胺聚糖类药物的抗AD研究具有指导作用，为LMWCS作为抗AD药物的开发提供了依据。