论文部分内容阅读
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalia target ofrapamycin，mTOR)属于P13K相关的激酶家族，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节细胞生长、细胞周期进程、蛋白质合成与降解、膜蛋白转运、蛋白激酶C信号传导等生命活动。mTOR通过PI3K/Akt/mTOR信号通路、Akt/TSC1-TSC2/Rheb/mTOR信号通路以及LKB1/AMPK/TSC/mTOR等信号通路调节靶蛋白磷酸化水平，参与介导生长、营养、能量获取等来调控细胞增殖、凋亡等过程，且mTOR处于肿瘤信号通路的关键位置，因此，mTOR抑制剂被广泛应用于肿瘤的靶向治疗。在综述mTOR抑制剂的结构特点、合成和药理作用机制的研究基础上，确定本文的研究内容为吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂的设计、合成和药理作用机制。所得结果不仅可以拓展mTOR抑制剂的结构类型，也可为新型mTOR抑制剂的研究提供坚实的理论与实验基础。
吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂的设计、合成及结构优化研究。利用骨架跃迁的药物设计方法，选取吡咯并[2，3-d]嘧啶酮为中心核，选择己报道的mTOR抑制剂的特征性取代基对中心核进行结构修饰，设计和优化的位点是4位药效团、7位疏水基和2位脂肪环，设计出未见文献报道的新型吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂。以丙二酸二乙酯和氯乙酰氯为起始原料，通过亲核取代反应、环合反应、氯代反应、芳香族亲核取代反应、环合反应和Suzuki反应等反应，合成吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物。对合成过程中所涉及的影响因素进行系统的研究，以期得到简单易行和高效的合成方法;通过1H-NMR、13C-NMR和HRMS等检测方法对所合成的目标化合物进行结构确认。采用CCK-8法，评价吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG和人前列腺癌细胞PC-3细胞活性，根据细胞活性结果，进一步优化吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂的结构。共计获得A、B、C、D四个系列未见文献报道的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物66个。目标化合物对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG和人前列腺癌细胞PC-3细胞活性表明，部分目标化合物显示出好的细胞活性，其中目标化合物A3、C1、C10、D4和D10对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG抑制率优于阳性对照PI-103;目标化合物A3、C1、C10、D4和D9对人前列腺癌细胞PC-3抑制率优于阳性对照PI-103。
吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂药理作用机理研究。在细胞水平对细胞活性优异的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类目标化合物的药理作用机理进行研究，其中目标化合物C1对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG具有明显的细胞毒活性，其IC50达到12.71μM，与阳性对照PI-103相当(IC50=8.49μM);化合物C1对人前列腺癌细胞PC-3也具有明显的细胞毒活性，其IC50达到10.31μM，与阳性对照PI-103相当(IC50=7.55μM)。对目标化合物C1进行mTDR和PI3Kα激酶水平的药理活性IC50研究，结果表明目标化合物C1对mTOR激酶抑制的IC50为54±8nM，与阳性对照BEZ235相当(IC50=55±1nM)，并且对P13Kα有一定选择性。利用计算机辅助药物设计手段，采用软件EPIWEB4.1和SwissADME在线数据库对所合成的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物的脂水分配系数和拓扑极性表面积等类药性进行研究，结果表明目标化合物基本满足类药5原则要求，大部分目标化合物有良好的口服吸收作用，部分化合物还具有潜在的透过血脑屏障的能力。利用分子对接AutoDock4.2平台，对所合成的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物与mToR进行分子对接研究，结果表明活性优异的化合物具备如下结构特征:①2位脂肪环为6元脂肪环，延伸至腺嘌呤口袋，其对位需要有杂原子作为氢键受体并与铰链区Val2240形成氢键;②4位药效团应该与内口袋结合并与氨基酸残基形成氢键:③7位疏水基在活性位点口袋边缘，起到调节溶解度和跨膜吸收强度的作用。免疫印迹评价和细胞周期分析等作用机理研究结果表明，目标化合物C1在10μM浓度完全抑制U87MG细胞系中mTORC1的底物S6K1的磷酸化，说明目标化合物C1为mTORC1抑制剂;Akt的Ser473处剂量依赖性的磷酸化抑制作用表明，目标化合物C1对mTORC2具有一定抑制作用:目标化合物C1能够阻滞乳腺癌细胞系MCF-7在细胞周期G1期并伴随S期细胞比例降低，综合以上结果表明目标化合物C1为mTORC1/mTORC2双靶点抑制剂。
吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂的设计、合成及结构优化研究。利用骨架跃迁的药物设计方法，选取吡咯并[2，3-d]嘧啶酮为中心核，选择己报道的mTOR抑制剂的特征性取代基对中心核进行结构修饰，设计和优化的位点是4位药效团、7位疏水基和2位脂肪环，设计出未见文献报道的新型吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂。以丙二酸二乙酯和氯乙酰氯为起始原料，通过亲核取代反应、环合反应、氯代反应、芳香族亲核取代反应、环合反应和Suzuki反应等反应，合成吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物。对合成过程中所涉及的影响因素进行系统的研究，以期得到简单易行和高效的合成方法;通过1H-NMR、13C-NMR和HRMS等检测方法对所合成的目标化合物进行结构确认。采用CCK-8法，评价吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG和人前列腺癌细胞PC-3细胞活性，根据细胞活性结果，进一步优化吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂的结构。共计获得A、B、C、D四个系列未见文献报道的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物66个。目标化合物对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG和人前列腺癌细胞PC-3细胞活性表明，部分目标化合物显示出好的细胞活性，其中目标化合物A3、C1、C10、D4和D10对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG抑制率优于阳性对照PI-103;目标化合物A3、C1、C10、D4和D9对人前列腺癌细胞PC-3抑制率优于阳性对照PI-103。
吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类mTOR抑制剂药理作用机理研究。在细胞水平对细胞活性优异的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类目标化合物的药理作用机理进行研究，其中目标化合物C1对人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG具有明显的细胞毒活性，其IC50达到12.71μM，与阳性对照PI-103相当(IC50=8.49μM);化合物C1对人前列腺癌细胞PC-3也具有明显的细胞毒活性，其IC50达到10.31μM，与阳性对照PI-103相当(IC50=7.55μM)。对目标化合物C1进行mTDR和PI3Kα激酶水平的药理活性IC50研究，结果表明目标化合物C1对mTOR激酶抑制的IC50为54±8nM，与阳性对照BEZ235相当(IC50=55±1nM)，并且对P13Kα有一定选择性。利用计算机辅助药物设计手段，采用软件EPIWEB4.1和SwissADME在线数据库对所合成的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物的脂水分配系数和拓扑极性表面积等类药性进行研究，结果表明目标化合物基本满足类药5原则要求，大部分目标化合物有良好的口服吸收作用，部分化合物还具有潜在的透过血脑屏障的能力。利用分子对接AutoDock4.2平台，对所合成的吡咯并[2，3-d]嘧啶酮类化合物与mToR进行分子对接研究，结果表明活性优异的化合物具备如下结构特征:①2位脂肪环为6元脂肪环，延伸至腺嘌呤口袋，其对位需要有杂原子作为氢键受体并与铰链区Val2240形成氢键;②4位药效团应该与内口袋结合并与氨基酸残基形成氢键:③7位疏水基在活性位点口袋边缘，起到调节溶解度和跨膜吸收强度的作用。免疫印迹评价和细胞周期分析等作用机理研究结果表明，目标化合物C1在10μM浓度完全抑制U87MG细胞系中mTORC1的底物S6K1的磷酸化，说明目标化合物C1为mTORC1抑制剂;Akt的Ser473处剂量依赖性的磷酸化抑制作用表明，目标化合物C1对mTORC2具有一定抑制作用:目标化合物C1能够阻滞乳腺癌细胞系MCF-7在细胞周期G1期并伴随S期细胞比例降低，综合以上结果表明目标化合物C1为mTORC1/mTORC2双靶点抑制剂。