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阿尔茨海默病(Alzheimcrs disease，AD)是一种神经性退行性疾病，主要的病理表现是β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)沉积形成的老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)，以及神经胶质细胞激活引起的炎症反应。AD的发病机制尚不明确，但是目前认为淀粉样蛋白级联假说是最重要的发病机制。该假说认为，Aβ可诱导神经元丢失、胶质细胞活化进而引发炎症反应、突触功能障碍、NFTs等，最终导致认知功能损伤。Aβ是由淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein，APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶依次剪切所产生的。此外在非淀粉样途径中，APP经α-分泌酶和γ-分泌酶剪切产生可溶性的APP(sAPPα)和p3，此过程可减少Aβ的产生。因此，抑制APP淀粉样剪切途径或者促进APP非淀粉样剪切途径都有利于延缓AD的病理进程。
近年来研究表明，铜的长期摄入可促进APP淀粉样剪切途径并加剧Aβ的沉积，最终导致AD认知功能障碍。AD患者脑内铜含量明显高于同龄的正常人，且脑内铜离子含量随着年龄的增长逐渐增加。因此，调节脑内铜可能会减少Aβ的产生，进而改善AD的病理变化。已有研究显示，铜离子螯合剂氯碘羟喹(Clioquinol，CQ)通过与铜和锌螯合进而减少金属离子诱导的Aβ聚集;曲恩汀(Trientine)能显著减低APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块的形成，同时也能减少斑块中铜和锌的积累。四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate，TM)能显著抑制Tg2576转基因小鼠脑内Aβ的产生及认知功能障碍，但是其作用机制尚不十分清楚。
为了深入研究铜离子螯合剂TM对AD的药效作用及分子机制，本论文选用6月龄的雄性APP/PS1转基因小鼠作为AD模型小鼠，随机分为3组，分别为:对照组、低浓度给药组(6 mg/L TM)、高浓度给药组(12 mg/L TM)。通过饮水给予TM3个月后，进行Moms水迷宫及絮窝行为实验，检测小鼠的学习记忆能力等行为学变化。结果显示，12mg/LTM能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的学习能力。免疫组化结果显示，12mg/LTM显著减少APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积。由于TM是一种铜离子螯合剂，因而本研究采用原子吸收光谱和Westernblot方法检测TM对脑内铜及其相关蛋白的影响。结果发现，TM对小鼠脑内铜离子含量及铜转运因子1(Copper transporter, Ctr1)无明显影响，但是TM显著提高铜伴侣蛋白(Copper chaperone for superoxide dismutase 1，CCS)的表达。结果提示，TM减少Aβ沉积与脑内的铜含量无关，可能与调节铜稳态有关。
由于铜可促进APP淀粉样剪切途径加剧Aβ沉积，因此，我们通过Westernblot方法检测APP淀粉样途径和非淀粉样途径的剪切酶，以考察TM是否能够调节APP的剪切途径。结果显示，TM对淀粉样途径的β-分泌酶和γ-分泌酶并无影响，但是，对非淀粉样途径中最主要的α-分泌酶去整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)及其产物sAPPα具有明显的促进作用。结果表明，TM通过诱导ADAM10的表达进而促进APP非淀粉样途径剪切，抑制Aβ产生。
为探讨TM促进ADAM10表达的分子机制，我们检测了APP/PS1转基因小鼠脑内和稳定转染APPsw的N2a细胞(N2a-sw)中ERK信号通路，结果显示，TM显著激活ERK，这与褪黑素通过其受体激活ERK促进ADAM10的表达结果相似。由于褪黑素及其代谢产物具有铜离子螯合剂的功能，因此，我们推测，铜离子螯合剂可能都是通过褪黑素受体(Melatonin receptor, MT1/2)及其下游PLC/PKC/ERK、PI3K/PDK1/PKC/ERK、cAMP/PKA/ERK和cAMP/PKA/CREB信号通路诱导ADAM10的表达。我们实验结果发现，另外一种铜离子螯合剂浴铜灵磺酸盐(Bathocuproine sulfonate，BCS)和TM都能促进ADAM10的表达，并能激活PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路。然而褪黑素受体非特异性抑制剂(luzindole)和MT2特异性抑制(4-P-PDOT)显著抑制TM和BCS诱导的ADAM10表达。结果提示，铜离子螯合剂诱导ADAM10的表达依赖于MT1/2及其下游PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路，促进APP非淀粉样途径的剪切，减少Aβ产生。
除了Aβ外，炎症反应也能促进AD的病理进程，而铜作为炎症反应的介质可诱发炎症反应。本研究采用免疫荧光、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平检测、电感耦合等离子质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)和Westernblot等方法探讨TM对APP/PS1转基因小鼠脑内炎症反应的影响及分子机制。结果显示，TM能够抑制APP/PS1转基因小鼠脑内胶质细胞的活化，减少肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)的释放及诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthesis，iNOS)的产生，上调超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase1, SOD1)的活性。为了进一步考察TM的抗炎作用及其分子机制，我们采用LPS刺激小鼠小胶质瘤BV-2细胞作为体外模型。结果显示，TM显著抑制炎症因子的释放和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)的泛素化以及核转录因子(TranscriptionfactornuclearfactorκB，NFκB)的活化。通过检测ROS和SOD1的活性时，我们发现TM的抗炎作用与减少生物活性的铜有关。结果提示，TM通过抑制ROS/TRAF6/AKT/NFκB信号通路发挥其抗炎作用。
此外，大量研究表明，Aβ清除减弱是造成晚发性AD的重要原因。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1，LRP1)与其配体载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)在Aβ的清除过程中具有重要作用。铜的长期摄入可减少LRP1表达进而损害脑内Aβ的清除。因此，本研究采用Westernblot方法探讨TM是否能够调节LRP1和ApoE介导的Aβ清除。结果显示，TM能够显著促进LRP1和ApoE介导的在APP/PS1转基因小鼠脑中Aβ的清除。
综上所述，本论文的研究结果表明，TM抑制APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑的产生，改善学习能力。其作用机制是通过MT1/2介导PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路诱导ADAM10的表达，促进APP非淀粉样途径的剪切，减少Aβ产生及促进LRP1和ApoE介导的Aβ清除。此外，TM可抑制APP/PS1转基因小鼠脑内的炎症反应，主要是通过抑制ROS/TRAF6/AKT/NFκB信号通路及减少生物活性铜来发挥其抗炎作用。
近年来研究表明，铜的长期摄入可促进APP淀粉样剪切途径并加剧Aβ的沉积，最终导致AD认知功能障碍。AD患者脑内铜含量明显高于同龄的正常人，且脑内铜离子含量随着年龄的增长逐渐增加。因此，调节脑内铜可能会减少Aβ的产生，进而改善AD的病理变化。已有研究显示，铜离子螯合剂氯碘羟喹(Clioquinol，CQ)通过与铜和锌螯合进而减少金属离子诱导的Aβ聚集;曲恩汀(Trientine)能显著减低APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块的形成，同时也能减少斑块中铜和锌的积累。四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate，TM)能显著抑制Tg2576转基因小鼠脑内Aβ的产生及认知功能障碍，但是其作用机制尚不十分清楚。
为了深入研究铜离子螯合剂TM对AD的药效作用及分子机制，本论文选用6月龄的雄性APP/PS1转基因小鼠作为AD模型小鼠，随机分为3组，分别为:对照组、低浓度给药组(6 mg/L TM)、高浓度给药组(12 mg/L TM)。通过饮水给予TM3个月后，进行Moms水迷宫及絮窝行为实验，检测小鼠的学习记忆能力等行为学变化。结果显示，12mg/LTM能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的学习能力。免疫组化结果显示，12mg/LTM显著减少APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积。由于TM是一种铜离子螯合剂，因而本研究采用原子吸收光谱和Westernblot方法检测TM对脑内铜及其相关蛋白的影响。结果发现，TM对小鼠脑内铜离子含量及铜转运因子1(Copper transporter, Ctr1)无明显影响，但是TM显著提高铜伴侣蛋白(Copper chaperone for superoxide dismutase 1，CCS)的表达。结果提示，TM减少Aβ沉积与脑内的铜含量无关，可能与调节铜稳态有关。
由于铜可促进APP淀粉样剪切途径加剧Aβ沉积，因此，我们通过Westernblot方法检测APP淀粉样途径和非淀粉样途径的剪切酶，以考察TM是否能够调节APP的剪切途径。结果显示，TM对淀粉样途径的β-分泌酶和γ-分泌酶并无影响，但是，对非淀粉样途径中最主要的α-分泌酶去整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)及其产物sAPPα具有明显的促进作用。结果表明，TM通过诱导ADAM10的表达进而促进APP非淀粉样途径剪切，抑制Aβ产生。
为探讨TM促进ADAM10表达的分子机制，我们检测了APP/PS1转基因小鼠脑内和稳定转染APPsw的N2a细胞(N2a-sw)中ERK信号通路，结果显示，TM显著激活ERK，这与褪黑素通过其受体激活ERK促进ADAM10的表达结果相似。由于褪黑素及其代谢产物具有铜离子螯合剂的功能，因此，我们推测，铜离子螯合剂可能都是通过褪黑素受体(Melatonin receptor, MT1/2)及其下游PLC/PKC/ERK、PI3K/PDK1/PKC/ERK、cAMP/PKA/ERK和cAMP/PKA/CREB信号通路诱导ADAM10的表达。我们实验结果发现，另外一种铜离子螯合剂浴铜灵磺酸盐(Bathocuproine sulfonate，BCS)和TM都能促进ADAM10的表达，并能激活PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路。然而褪黑素受体非特异性抑制剂(luzindole)和MT2特异性抑制(4-P-PDOT)显著抑制TM和BCS诱导的ADAM10表达。结果提示，铜离子螯合剂诱导ADAM10的表达依赖于MT1/2及其下游PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路，促进APP非淀粉样途径的剪切，减少Aβ产生。
除了Aβ外，炎症反应也能促进AD的病理进程，而铜作为炎症反应的介质可诱发炎症反应。本研究采用免疫荧光、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平检测、电感耦合等离子质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)和Westernblot等方法探讨TM对APP/PS1转基因小鼠脑内炎症反应的影响及分子机制。结果显示，TM能够抑制APP/PS1转基因小鼠脑内胶质细胞的活化，减少肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)的释放及诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthesis，iNOS)的产生，上调超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase1, SOD1)的活性。为了进一步考察TM的抗炎作用及其分子机制，我们采用LPS刺激小鼠小胶质瘤BV-2细胞作为体外模型。结果显示，TM显著抑制炎症因子的释放和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)的泛素化以及核转录因子(TranscriptionfactornuclearfactorκB，NFκB)的活化。通过检测ROS和SOD1的活性时，我们发现TM的抗炎作用与减少生物活性的铜有关。结果提示，TM通过抑制ROS/TRAF6/AKT/NFκB信号通路发挥其抗炎作用。
此外，大量研究表明，Aβ清除减弱是造成晚发性AD的重要原因。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1，LRP1)与其配体载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)在Aβ的清除过程中具有重要作用。铜的长期摄入可减少LRP1表达进而损害脑内Aβ的清除。因此，本研究采用Westernblot方法探讨TM是否能够调节LRP1和ApoE介导的Aβ清除。结果显示，TM能够显著促进LRP1和ApoE介导的在APP/PS1转基因小鼠脑中Aβ的清除。
综上所述，本论文的研究结果表明，TM抑制APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑的产生，改善学习能力。其作用机制是通过MT1/2介导PLC/MEK/ERK和PKA/CREB信号通路诱导ADAM10的表达，促进APP非淀粉样途径的剪切，减少Aβ产生及促进LRP1和ApoE介导的Aβ清除。此外，TM可抑制APP/PS1转基因小鼠脑内的炎症反应，主要是通过抑制ROS/TRAF6/AKT/NFκB信号通路及减少生物活性铜来发挥其抗炎作用。