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目的：双歧杆菌和乳杆菌等乳酸菌是消化道内最重要的生理性益生菌群,本研究通过建立双歧杆菌和乳杆菌的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测技术,对肠外营养幼兔肠道双歧杆菌和乳杆菌的变化、不同分娩方式下健康新生儿肠道双歧杆菌和乳杆菌的定植过程、先天性消化道畸形新生儿术后肠道双歧杆菌和乳杆菌的定植过程进行系列研究.
材料与方法:
1.荧光定量PCR技术建立:根据双歧杆菌和乳杆菌16sDNA序列合成属特异性引物,抽提双歧杆菌和乳杆菌冻干菌粉中细菌组DNA,应用引物扩增特异性目标片断,经转染、克隆制备外标准品,系列稀释后进行实时荧光定量PCR扩增,获取标准曲线,分析特异性、敏感性、重复性,并对已知浓度样品和未知浓度粪便样品进行验证性分析.
2.外源性双歧杆菌对PN幼兔肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的影响:生后2周的新西兰种白兔分为对照组、PN组和PN+双歧杆菌组.对照组母乳喂养,PN组每日经颈静脉插管连续24h输入营养液(210kcal/kg/d)；PN斗双歧组在输入和PN组等热量营养液同时,每日经胃管给予双歧杆菌活菌0.5×10<8>.实验第10d,对幼兔粪便进行双歧杆菌和乳杆菌定量分析.
3.不同分娩方式下母乳喂养新生儿肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的研究:以2006年1月至2006年12月于我院出生的阴道分娩和剖腹产分娩的健康足月母乳喂养新生儿各20例为观察对象,连续检测其生后7天粪便内双歧杆菌和乳杆菌的数量.
4.先天性消化道畸形新生儿术后肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的研究:以2006年1月～2007年2月我院儿外科连续收治的12例先天性食道闭锁和先天性小肠闭锁新生儿作为研究对象,连续检测其住院期间粪便内双歧杆菌和乳杆菌的数量,并记录相关临床资料,分析影响其肠道定植的可能因素.
结果：
1.荧光定量PCR技术建立:应用属特异性引物作常规PCR,电泳显示双歧杆菌扩增条带为1428bp,乳杆菌扩增条带为600bp,阴性对照大肠杆菌未见扩增条带,说明所用引物能准确鉴别双歧杆菌和乳杆菌；梯度稀释外标准品后进行Real-time PCR扩增获得6浓度梯度的标准曲线,回归系数r>0.99,灵敏度达10<2>,复孔扩增显示重复性良好,扩增产物溶解曲线显示单峰,说明产物单一.已知浓度样品检测结果精确,粪便样品检测结果均成阳性.
2.外源性双歧杆菌对PN幼兔肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的影响:PN组幼兔双歧杆菌和乳杆菌含量(log拷贝数/0.05g湿粪)分别为4.62±0.24和4.29±0.49,显著低于对照组 (分别为5.84±0.92,5.14±1.07,P<0.01) 和双歧组(6.41±0.39,5.46±0.61,P<0.01)；双歧组两菌含量略高于对照组,但差异无显著性(P>0.05).
3.不同分娩方式下母乳喂养新生儿肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的研究:生后一周内阴道分娩组双歧杆菌数量(10g拷贝数/g湿粪)由5.1升至9.3,剖腹产组由低于4.6的检测低限值升至8.7,两组差异显著(P<0.05),剖腹产组有6例新生儿生后第2天双歧杆菌检测阴性；阴道分娩组乳杆菌数量由4.9升至7.2,剖腹产组由4.9升至6.9,两组差异无显著性(P>0.05).
4.先天性消化道畸形新生儿术后肠道双歧杆菌和乳杆菌早期定植的研究:双歧杆菌定植时间为生后13天,乳杆菌为12天；双歧杆菌和乳杆菌定植时间随抗生素应用时间不同而变化.双歧杆菌和乳杆菌数量在患儿达到全肠内喂养后出现一个较快的增长期,乳杆菌增殖速度较双歧杆菌快,出院时患儿肠道内双歧杆菌平均水平(10g拷贝数儋湿粪)为6.05,乳杆菌平均水平为7.01.
小结:
1.应用实时荧光定量PCR技术能对粪便样品内的双歧杆菌和乳杆菌做精确定量分析.
2.PN导致幼兔肠道内双歧杆菌和乳杆菌数量减少；外源性双歧杆菌干预后可提高PN幼兔肠道内双歧杆菌和乳杆菌数量.
3.剖腹产对健康足月母乳喂养新生儿肠道内双歧杆菌定植的影响大于对乳杆菌的影响.
4.先天性消化道畸形新生儿术后肠道双歧杆菌和乳杆菌定植时间延迟、水平下降,定植时间受抗生素应用时间影响明显,增殖速度与全肠内营养有关.
结论：长期肠外营养、剖腹产、先天性消化道畸形、抗生素治疗均会对肠道内双歧杆菌和乳杆菌的早期定植产生不利影响,补充外源性益生菌可能成为纠正肠道菌群失衡的一种可行途径；实时荧光定量PCR技术在消化道双歧杆菌和乳杆菌的研究中具有较好的临床应用前景.