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低温是植物面临的环境胁迫因子之一，能够对植物造成伤害，严重时导致植物死亡，制约着植物的生长发育和地理分布。植物在长期进化过程中，形成了对低温胁迫适应的机制--低温驯化(Cold acclimation)。低温驯化是一个极其复杂的过程，在这一过程中植物的许多生理过程发生改变(如累积可溶性糖、游离氨基酸、甜菜碱和抗冻蛋白等)。低温驯化过程也影响基因的表达，其中CBF(CRT-binding factor)家族在植物对低温胁迫的适应过程中发挥着十分重要的作用。黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是广泛分布于我国北方温带草原的重要豆科牧草，具有耐旱耐寒的特性。但是目前对黄花苜蓿抗冻的研究主要集中在生理和形态学方面，关于抗冻分子机制的研究较少。蒺藜苜蓿(Medicago truncatulaGaertn)是近年来发展起来的豆科模式植物，其基因组测序的完成将为豆科植物的研究提供丰富的遗传和分子生物学基础。本文对黄花苜蓿和蒺藜苜蓿的低温驯化特性和抗冻机制进行了比较研究：在此基础上，将蒺藜苜蓿的MtCAS31(Cold acclimation specific)基因在拟南芥中异源表达，探讨了MtCAS31在植物响应多种环境胁迫中的作用；同时对植物激素乙烯在蒺藜苜蓿低温胁迫响应中的作用进行了研究。主要结果如下：
⑴以黄花苜蓿和蒺藜苜蓿为材料，从生理和分子水平研究了它们的抗冻机理。结果表明黄花苜蓿和蒺藜苜蓿都具有低温驯化特性，经过低温驯化，抗冻性增加，相比而言黄花苜蓿的增加幅度更大。随着低温驯化时间的延长，两种苜蓿叶片中可溶性糖和脯氨酸含量增加，但黄花苜蓿中蔗糖和脯氨酸含量增加幅度更大。低温驯化过程诱导了黄花苜蓿中棉籽糖和水苏糖的少量增加，但是蒺藜苜蓿中没有检测到这两种糖。低温驯化过程中积累的可溶性物质同时增加了叶片的渗透压摩尔浓度。通过分析低温驯化获得的抗冻性与这一过程中积累的可溶性糖、脯氨酸含量和渗透压摩尔浓度的相关性，发现黄花苜蓿中低温驯化获得的抗冻性与积累的可溶性总糖和蔗糖含量及渗透压摩尔浓度呈正相关，而蒺藜苜蓿的抗冻性仅与脯氨酸含量呈正相关。进一步的研究发现，低温驯化过程中积累的可溶性糖源于蔗糖合成酶SPS(Sucrose phosphate synthase)活性的增加和代谢酶AI(Acid invertase)活性的降低以及相应编码基因表达的变化，说明低温驯化通过基因表达和酶活性两个层次的调控，影响蔗糖合成；黄花苜蓿蔗糖合成酶基因表达和酶活性高于蒺藜苜蓿，这与低温驯化过程中黄花苜蓿中蔗糖含量高于蒺藜苜蓿相一致。脯氨酸合成基因P5CS1转录水平表达量的增加是低温驯化增加脯氨酸累积的主要原因。CBF途径是植物响应低温胁迫的重要途径，CBF和其下游COR基因表达量往往与植物的抗冻性呈正相关，因此本研究又探讨了低温驯化对苜蓿CBF基因和其下游CAS基因表达变化的影响，发现低温驯化过程中两种苜蓿的CBF基因都受低温诱导表达，并且CBF2在蒺藜苜蓿中表达量高，CBF3在黄花苜蓿中表达量高。低温持续诱导CAS基因的表达，除CAS15外其它的CAS基因均在黄花苜蓿中表达量高。
⑵将蒺藜苜蓿的Mt CAS31基因转入模式植物拟南芥，研究了转基因拟南芥对盐、渗透和低温胁迫的抗性。结果表明Mt CAS31提高了转基因拟南芥种子NaCl、甘露醇和ABA处理条件下的萌发速率，并提高了萌发后期子叶的形成比例，然而不同处理条件下幼苗的根伸长与野生型相比差异不显著。MtCAS31通过降低转基因拟南芥株系的MDA和H2O2含量提高了对渗透胁迫的抗性；转基因株系通过减少体内Na+含量来维持较低的Na+/K+从而降低对NaCl敏感性；转基因拟南芥冷冻抗性增加，主要表现在不同低温处理下相对电导率降低和冷冻处理后存活率增加。低温处理条件下转基因拟南芥中低温应答相关基因(CBF1，CBF2，CBF3，COR15α和KIN1)的表达量高于野生型。
⑶以蒺藜苜蓿为材料研究了乙烯在苜蓿响应低温胁迫过程中的作用。结果表明，低温驯化过程中蒺藜苜蓿的乙烯释放量下降，主要源于ACS(ACCsynthase)活性和ACO(ACC oxidase)活性的降低；ACS编码基因中ACS7的表达量下调，与乙烯的释放量一致；外源AVG处理抑制乙烯的释放，而对蔗糖和脯氨酸代谢相关基因的表达影响不大，但是能诱导CBF及其靶基因CAS基因的表达，提高苜蓿对冷冻的抗性。本研究发现低温驯化过程中高表达量的CBF3和CAS基因以及低温驯化过程中积累的可溶性糖和脯氨酸使得黄花苜蓿比蒺藜苜蓿更抗冻；超表达MtCAS31的转基因拟南芥提高了对盐、渗透和低温胁迫的抗性，主要通过减少渗透胁迫下MDA和H2O2含量提高对渗透胁迫的抗性，减少Na+/K+提高对盐胁迫的抗性，低温应答相关基因(CBF1，CBF2，CBF3，COR15α和KIN1)表达量提高增加了对低温胁迫的抗性；最后，植物激素乙烯负调控苜蓿低温驯化过程的研究结果，为乙烯新功能的发现提供了证据和思路。