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背景：脑中风会造成严重的残疾甚至死亡，研究表明85%的中风是缺血性的，然而恢复血流后却会由于血液的重新灌注带来的大量活性氧的生成对脑组织造成进一步更严重的损伤，称为脑缺血再灌注脑损伤（cerebral ischemia reperfusion,CI/R），对于改善CI/R方面现已取得一些初步进展，然而目前临床上尚无有效的治疗药物，且与之相关的确切分子机制尚不明确。rLj-RGD4是由重组日本七鳃鳗口腔腺rLj-RGD3经设计截短后获得的含有4个RGD（Arg-Gly-Asp）序列的可溶性蛋白，蛋白分子量为6.27kDa，氨基酸数量为57个，基因长度为354bp。本组以往研究表明rLj-RGD4具有抗血栓、抗肿瘤、保护CI/R的作用，但rLj-RGD4是否能通过调控Integrinβ3/p66Shc信号通路调节CI/R尚未见报道。
目的：本文旨在研究rLj-RGD4对脑缺血再灌注脑损伤的保护作用及其作用机制，初步探讨rLj-RGD4保护CI/R与Integrinβ3/p66Shc信号通路之间的关系。
方法：（1）rLj-RGD4对大鼠CI/R保护作用的研究：体重为200-240g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组：正常组、正常+给药组（rLj-RGD450μg/kg）、模型组、模型+给药低剂量组（rLj-RGD425μg/kg）、模型+给药高剂量组（rLj-RGD450μg/kg）。采用线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，模型+给药组大鼠于缺血2h后自舌下静脉注射给药，正常组及模型组给予等容量生理盐水。观察并记录各组大鼠行为学变化，进行神经行为学评分；采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和TTC染色法，检查脑组织的病理学改变并计算脑梗死体积占比；试剂盒检测大鼠脑组织中丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽（GSH）的水平；采用蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠脑组织中cleaved caspase3（c-caspase3）、Bcl2、SOD2、p66Shc、p-p66Shc、p-Integrinβ3蛋白含量水平；免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）检测Integrinβ3与p66Shc蛋白之间的作用关系。
（2）rLj-RGD4对PC12细胞缺氧复氧损伤的保护作用：将PC12细胞分为5组：正常组、正常+给药组（rLj-RGD40.5μM）、模型组（OGD/R）、模型+给药低剂量组（rLj-RGD40.25μM）、模型+给药高剂量组（rLj-RGD40.5μM）。采用缺氧4h，复氧24h以构建细胞缺氧复氧模型。采用WST-1法检测不同浓度rLj-RGD4对PC12细胞活力的影响；采用AO/EB染色法和TUNEL染色法检测细胞凋亡水平；采用DCFH-DA染料对PC12细胞进行荧光染色，测定细胞内活性氧（ROS）水平；Western blotting法检测PC12细胞内cleaved caspase3、Bcl2、SOD2、p66Shc、p-p66Shc、p-Integrinβ3蛋白表达水平。
结果：（1）rLj-RGD4对大鼠CI/R的保护作用：与正常组相比，模型组大鼠行为学评分明显升高；TTC染色结果显示有明显的脑梗死现象；HE染色结果显示脑组织出现水肿，细胞体积变大，神经元排列紊乱等现象；SOD、GSH水平下降，MDA、LDH水平上升；脑组织中cleaved caspase3蛋白表达上升，而Bcl2、SOD2蛋白水平表达下降，p66Shc、p-p66Shc表达水平明显提高，p-Integrinβ3蛋白水平下降。与模型组相比，各给药组大鼠行为学评分下降；脑梗死体积减小；组织水肿减轻，神经元损伤减轻；SOD、GSH水平提高，MDA、LDH水平下降；cleaved caspase3蛋白表达下降，Bcl2、SOD2蛋白水平表达增多，p66Shc、p-p66Shc表达水平显著下降，p-Integrinβ3蛋白水平明显上升。Co-IP实验发现正常组和模型组中Integrinβ3与p66Shc均有结合。
（2）rLj-RGD4对PC12细胞OGD/R（oxygen-glucose deprivation reintroduction，缺氧缺糖复氧复糖）的保护作用：确定rLj-RGD4的受试浓度为0.25μM和0.5μM；与正常组相比，模型组出现细胞凋亡和氧化应激现象；细胞中cleaved caspase3蛋白表达升高，Bcl2、SOD2蛋白水平表达下降，p66Shc、p-p66Shc表达水平升高，p-Integrinβ3水平降低。与模型组相比，各给药组显著改善细胞OGD/R的损伤，细胞中cleaved caspase3蛋白表达下降，Bcl2、SOD2表达水平升高，p66Shc、p-p66Shc蛋白表达下降，p-Integrinβ3蛋白水平提高。
结论：rLj-RGD4具有明显的保护脑缺血再灌注损伤的作用，其保护作用的可能分子机制是通过调节Integrinβ3/p66Shc信号通路。
目的：本文旨在研究rLj-RGD4对脑缺血再灌注脑损伤的保护作用及其作用机制，初步探讨rLj-RGD4保护CI/R与Integrinβ3/p66Shc信号通路之间的关系。
方法：（1）rLj-RGD4对大鼠CI/R保护作用的研究：体重为200-240g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组：正常组、正常+给药组（rLj-RGD450μg/kg）、模型组、模型+给药低剂量组（rLj-RGD425μg/kg）、模型+给药高剂量组（rLj-RGD450μg/kg）。采用线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，模型+给药组大鼠于缺血2h后自舌下静脉注射给药，正常组及模型组给予等容量生理盐水。观察并记录各组大鼠行为学变化，进行神经行为学评分；采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和TTC染色法，检查脑组织的病理学改变并计算脑梗死体积占比；试剂盒检测大鼠脑组织中丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽（GSH）的水平；采用蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠脑组织中cleaved caspase3（c-caspase3）、Bcl2、SOD2、p66Shc、p-p66Shc、p-Integrinβ3蛋白含量水平；免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）检测Integrinβ3与p66Shc蛋白之间的作用关系。
（2）rLj-RGD4对PC12细胞缺氧复氧损伤的保护作用：将PC12细胞分为5组：正常组、正常+给药组（rLj-RGD40.5μM）、模型组（OGD/R）、模型+给药低剂量组（rLj-RGD40.25μM）、模型+给药高剂量组（rLj-RGD40.5μM）。采用缺氧4h，复氧24h以构建细胞缺氧复氧模型。采用WST-1法检测不同浓度rLj-RGD4对PC12细胞活力的影响；采用AO/EB染色法和TUNEL染色法检测细胞凋亡水平；采用DCFH-DA染料对PC12细胞进行荧光染色，测定细胞内活性氧（ROS）水平；Western blotting法检测PC12细胞内cleaved caspase3、Bcl2、SOD2、p66Shc、p-p66Shc、p-Integrinβ3蛋白表达水平。
结果：（1）rLj-RGD4对大鼠CI/R的保护作用：与正常组相比，模型组大鼠行为学评分明显升高；TTC染色结果显示有明显的脑梗死现象；HE染色结果显示脑组织出现水肿，细胞体积变大，神经元排列紊乱等现象；SOD、GSH水平下降，MDA、LDH水平上升；脑组织中cleaved caspase3蛋白表达上升，而Bcl2、SOD2蛋白水平表达下降，p66Shc、p-p66Shc表达水平明显提高，p-Integrinβ3蛋白水平下降。与模型组相比，各给药组大鼠行为学评分下降；脑梗死体积减小；组织水肿减轻，神经元损伤减轻；SOD、GSH水平提高，MDA、LDH水平下降；cleaved caspase3蛋白表达下降，Bcl2、SOD2蛋白水平表达增多，p66Shc、p-p66Shc表达水平显著下降，p-Integrinβ3蛋白水平明显上升。Co-IP实验发现正常组和模型组中Integrinβ3与p66Shc均有结合。
（2）rLj-RGD4对PC12细胞OGD/R（oxygen-glucose deprivation reintroduction，缺氧缺糖复氧复糖）的保护作用：确定rLj-RGD4的受试浓度为0.25μM和0.5μM；与正常组相比，模型组出现细胞凋亡和氧化应激现象；细胞中cleaved caspase3蛋白表达升高，Bcl2、SOD2蛋白水平表达下降，p66Shc、p-p66Shc表达水平升高，p-Integrinβ3水平降低。与模型组相比，各给药组显著改善细胞OGD/R的损伤，细胞中cleaved caspase3蛋白表达下降，Bcl2、SOD2表达水平升高，p66Shc、p-p66Shc蛋白表达下降，p-Integrinβ3蛋白水平提高。
结论：rLj-RGD4具有明显的保护脑缺血再灌注损伤的作用，其保护作用的可能分子机制是通过调节Integrinβ3/p66Shc信号通路。