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miRNA是一类长度约为22 nt的非编码RNA,可以和靶标m RNA完全结合,达到降解m RNA的目的或者通过种子序列与m RNA部分结合,抑制m RNA的蛋白翻译过程,在转录后翻译调控过程起到重要作用。在寄生虫中,miRNAs通过多种机制在调节生长发育、感染、宿主-寄生虫相互作用和发病机制,寿命延长等方面起到作用。粪类圆线虫是一种寄生在人和犬小肠内的肠道寄生性线虫,全球大约有1亿人受到感染,同时具有寄生世代和自由生活世代的复杂生活史。在健康个体中,粪类圆线虫的感染没有严重危害,但是在免疫抑制的个体中,可能会导致过感染,死亡率较高,是威胁全球人类健康的一个危险因素,因此对粪类圆线虫感染性三期（i L3）和寄生性雌虫时期（p F）两个时期的miRNA的鉴定和分析有助于了解粪类圆线虫miRNA功能,为研究粪类圆线虫miRNA的潜在功能及其作用机制奠定了基础。1.粪类圆线虫RNA测序数据质量提取粪类圆线虫两个时期虫体总RNA,送到华大公司进行测序,i L3-1、i L3-2、i L3-3和p F-1、p F-2、p F-3的总碱基分别为0.553G、0.550G、0.526G、0.529G、0.533G和0.544G;GC含量约为50%、Q20＞99%、Q30＞94%。与粪类圆线虫的基因组相比对,i L3和p F s RNA的比对率分别为88%和53%。2.miRNA的序列特征miRNA的长度分布于22个碱基左右,miRNA的首个碱基偏向性分析表明,miRNA的首个碱基偏向于尿嘧啶（U）。除去r RNA、t RNA、sn RNA、sno RNA,其他小RNA、重复序列、外显子、内含子,剩下的1.73%的i L3和18.17%的p F未注释的s RNA被视为是miRNA的候选物,包括已知和未知的miRNA。3.差异miRNAs的表征本次研究以鼠类圆线虫已经发表的miRNA作为参照,总共获得265个miRNAs,包括130个已知的和135个未知的miRNAs,两个发育阶段有134个显著差异表达的miRNAs,包括77个保守和57个未知的miRNAs,已鉴定出超过21个|Log2 Fold Chang|＞3的miRNAs,热图分析中,在三个生物学重复之间显示高度相关,进一步证明了本实验的准确性。4.保守miRNA的进化分析对保守的miRNA进行进化分析,发现高等动物所表达的miRNA的数量多于低等动物,并且miR-34和miR-92在后生动物中普遍存在,说明两个miRNA在后生生物中高度保守,可能在不同的生物中发挥重要作用,是不可或缺的miRNA。5.差异miRNA的靶基因的功能分析本次鉴定的134个差异的miRNAs,利用miRanda软件预测发现1494个靶基因,GO分析显示在分子功能类别中,miRNA的靶标主要集中在跨膜转运蛋白活性、信号转导活性、核酸结合等方面。在细胞成分类别中,miRNA的靶标主要富含细胞和肌球蛋白复合物。在生物过程类别中,miRNA的靶标主要集中在DNA重组、信号传导和DNA整合中。KEGG途径富集分析表明,靶基因在多种信号通路中发挥不同的功能,这些信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、Fox O信号通路、紧密连接、胰高血糖素信号通路,把这些通路里的基因与线虫的同源基因进一步分析预测这些靶基因可能在粪类圆线虫的蜕皮、调节寿命、调节运动功能、胚胎的发育和调节产卵行为发挥重要功能。6.miRNA的验证利用克隆方法,设计引物扩增粪类圆线虫的pre-miRNA,克隆到质粒,送到公司测序,发现测序结果与深度测序完全相符,说明测序数据的高质量性。利用RTPCR对11个差异miRNAs进行相对定量,发现9个miRNAs差异显著,并且RTPCR的结果与RNA-seq的趋势相同,这些结果表明miRNA测序数据是可信的,可为后续miRNA的研究提供有用的信息。7.应激条件下miRNA的转录水平分析温度应激中选取的Sst-miR-71-5p、Sst-miR-84-5p、Sst-miR-86-5p、Sst-miR-92-3p、Sst-miR-1-3p、Sst-miR-9-3、Sst-lin4-3p、Sst-miR-81a-5p、Sst-miR-34a-5p、Sst-novel-104共10个miRNA,在12℃、37℃、45℃相对自然生存温度22℃,发现大部分miRNA是下调的,其中Sst-novel-104、Sst-miR-84-5p在12℃上调。缺氧应激结果显示Sst-miR-84-5p、Sst-lin4-3p、Sst-novel-104、Sst-miR-92-3p显著下调,Sst-miR-81a-5p、Sst-miR-1-3p和Sst-miR-71-5p显著上调,Sst-miR-86-5p、Sst-miR-34a-5p、SstmiR-9-3p没有明显差异。紫外照射应激中发现所有的miRNA转录水平都显著下调。综上所述,本次研究表征了粪类圆线虫感染性三期（i L3）和寄生性雌虫（p F）时期的miRNA,发现差异表达的miRNA的功能在粪类圆线虫的运动、调节寿命、胚胎发育、产卵等方面起作用,应激实验显示多种miRNA丰度变化显示miRNA响应应激反应。所得的结果为进一步研究粪类圆线虫miRNA发挥的具体功能奠定了基础。