【摘 要】
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小肠在消化系统中发挥着消化、吸收、分泌和免疫的重要作用,肠道体外模拟在近年来逐渐成为一种重要的研究方法。微流控是一项涉及化学、物理、生物、医学的新兴技术,因具有许多突出的优点而被广泛使用。本研究基于微流控技术研制猪肠道微流控芯片,旨在更好地模拟肠道的结构与功能,深入地了解宿主与微生物之间的互作。试验一、肠道微流控芯片的制作及微流控芯片上IPEC-J2细胞的培养将设计好的通道图形打印成菲林掩膜,通过
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小肠在消化系统中发挥着消化、吸收、分泌和免疫的重要作用,肠道体外模拟在近年来逐渐成为一种重要的研究方法。微流控是一项涉及化学、物理、生物、医学的新兴技术,因具有许多突出的优点而被广泛使用。本研究基于微流控技术研制猪肠道微流控芯片,旨在更好地模拟肠道的结构与功能,深入地了解宿主与微生物之间的互作。试验一、肠道微流控芯片的制作及微流控芯片上IPEC-J2细胞的培养将设计好的通道图形打印成菲林掩膜,通过软光刻法将通道图形刻蚀在硅片上,构建出芯片模具。将配制好的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane,PDMS）浇筑于模具中,经过烘烤、切割、打孔、等离子体清洗器处理、键合等步骤后构建出肠道微流控芯片,杀菌、消毒后备用。选用多聚赖氨酸溶液（0.1mg/mL）或Ⅰ型胶原蛋白（0.1mg/mL）对通道进行包被处理,与不用包被物处理的芯片进行对比。分别于2、4、6 h对三组微流控芯片内贴壁活细胞进行染色并计数。设置0.5×106、1.0×106和2.0×106个/mL三种细胞接种密度进行试验,分别在培养1 d、2 d采用吖啶橙染色法统计活细胞数目,并计算出不同接种密度下的细胞增殖率。主要结果如下:（1）多聚赖氨酸组2、4h贴壁细胞数显著高于Ⅰ型胶原蛋白组（P＜0.05）,6h贴壁细胞数三组无显著差异（P＞0.05）。（2）1.0×106个/mL为芯片上适宜的细胞接种密度,此接种密度下细胞增殖快且稳定。试验二、肠道微流控芯片功能验证及宿主-肠道微生物互作模型的构建采用免疫荧光法对肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1进行验证。IPEC-J2细胞与肠道微生物互作结束后,将肠道芯片置于倒置荧光显微镜下观察嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌在IPEC-J2细胞上的定植情况。利用非靶向代谢组学分析方法对代谢产物及代谢通路进行分析。主要结果如下:（1）肠道微流控芯片培养5 d后可观察到紧密连接蛋白ZO-1表达,肠上皮细胞间具有良好的紧密连接。（2）嗜酸乳杆菌组观察到有大量活细菌,说明嗜酸乳杆菌在肠上皮细胞上有较好的定植能力;枯草芽孢杆菌组观察到较少的细菌,说明枯草芽孢杆菌不易黏附定植于肠上皮细胞。（3）主成分分析后,嗜酸乳杆菌组、枯草芽孢杆菌和对照组在正离子和负离子两种条件下均表现出差异聚集模式。对鉴定到的代谢物进行分类注释后,代谢物主要为苯及其衍生物、氨基酸、多肽、有机酸、碳水化合物、吲哚、酚、醇、胺,产物中的脂类主要是脂肪酸。（4）正离子模式下,嗜酸乳杆菌组与对照组之间有1540个差异代谢物,显著上调的差异代谢物380个,显著下调的差异代谢物1160个;枯草芽孢杆菌组与对照组之间有1593个差异代谢物,显著上调的差异代谢物459个,显著下调的差异代谢物1134个。负离子模式下,嗜酸乳杆菌组与对照组之间有373个差异代谢物,显著上调的差异代谢物90个,显著下调的差异代谢物283个;枯草芽孢杆菌组与对照组之间有394个差异代谢物,显著上调的差异代谢物105个,显著下调的差异代谢物289个。（5）通过KEGG数据库对鉴定到的代谢物进行代谢通路富集分析,两种微生物处理组较多差异代谢物富集到的通路是氨基酸代谢通路、不饱和脂肪酸代谢通路,以及碳水化合物代谢、维生素代谢、脂代谢、膜运输以及信号传导等代谢通路。综上所述,本研究主要结论为:（1）基于微流控技术研制的肠道微流控芯片经过包被物处理后,多聚赖氨酸包被效果优于Ⅰ型胶原蛋白,1.0×106个/mL为芯片上适宜的细胞接种密度。（2）通过验证紧密连接蛋白ZO-1,表明肠道微流控芯片中构建的肠上皮模型具有肠上皮屏障功能。（3）嗜酸乳杆菌具有黏附定植的能力,而枯草芽孢杆菌定植能力较弱或不黏附定植。两种肠道微生物代谢产物主要为苯及其衍生物、氨基酸、多肽、有机酸等,产物中的脂类主要是脂肪酸。有较多差异代谢物富集到的通路是氨基酸代谢通路、不饱和脂肪酸合成代谢通路。
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