论文部分内容阅读
近几年,非洲猪瘟肆虐,养殖行业也随之发生快速迭代,散养猪不断被集约化程度更高的大型养殖场所替代。由于通风与保温的矛盾,规模化猪场中,保育仔猪可能长期暴露于较高浓度的氨环境中,这将对仔猪的健康造成影响。本课题组前期研究已经发现,80ppm（56 mg/m~3）氨气短期暴露12天,仔猪鼻粘膜,气管和肺组织都发生不同程度的变化。本次研究选择低于保育猪舍国标上限的较低浓度氨气（20ppm或15mg/m~3）和超过国标上限的较高浓度氨气（50ppm或38 mg/m~3）对7周龄断奶仔猪进行长期慢性刺激30天,对照组不添加氨气。试验结束后,采集三组仔猪肺组织样品,对肺组织进行组织切片、HE染色和透射电镜观察,并进一步探讨氨暴露损伤肺泡上皮细胞以及影响仔猪肺表面活性蛋白表达的分子机制,研究结果总结如下:1.不同浓度氨暴露下仔猪肺组织HE染色和AECⅡ透射电镜观察结果对肺组织切片进行HE染色发现,20ppm氨气暴露30天,仔猪肺泡缩小,肺泡隔增厚。50ppm氨气暴露30天肺泡隔显著增厚,且肺泡数量大大减少。进一步通过肺组织透射电镜进行观察发现:20ppm氨暴露后,AECⅡ（Ⅱ型肺泡上皮细胞）细胞核形态变得不规则,出现核浓缩现象,LB（板层小体）排空现象明显;50ppm氨气暴露后,AECⅡ核萎缩现象进一步加剧,核内出现大量浓缩颗粒,同时LB排空现象明显。由于核浓缩是细胞不可复性损伤的标志,提示活体内细胞死亡（坏死）。因此,我们推论20ppm和50ppm氨暴露均对肺组织中AECⅡ造成了不同程度的损伤,可能引起肺泡上皮细胞的坏死,进而诱导间质细胞的增生,导致肺泡隔的增厚。2.不同浓度氨暴露下仔猪肺组织氧化应激信号通路检测结果为了进一步探讨氨暴露导致肺泡上皮细胞损伤的分子机制,本研究进一步检测了氧化应激相关指标和信号通路。首先使用ELISA试剂盒对仔猪肺组织总抗氧化物（T-AOC）和DNA损伤标志物8-OHd G进行测定。结果显示,T-AOC在20ppm和50ppm氨气暴露下均发生极显著下调（P＜0.01）,50ppm氨暴露后8-OHd G发生显著上调（P＜0.05）,表明仔猪肺组织中活性氧显著上升,高浓度氨气暴露下诱导了肺组织的氧化性损伤。接着,我们挑选了抗氧化基因SOD2,GPX-3,HSP70和HSPB7进行基因定量检测。q PCR结果发现,20ppm组氨气暴露后上述抗氧化基因mRNA水平均发生显著下调（P＜0.05）,50ppm组氨气暴露后只有HSPB7基因mRNA水平发生显著下调（P＜0.05）,其他基因表达无显著变化。进一步对氧化应激信号通路的核心因子NRF2和下游抗氧化酶基因NQO1,HO-1以及NRF2的3个上游调控因子P38MAPK,PKC和PI3K进行mRNA和蛋白水平的检验。结果发现,NRF2,NQO1和HO-1基因mRNA和蛋白水平在20ppm和50ppm氨气暴露后均发生显著（P＜0.05）/极显著上调（P＜0.01）;PKC蛋白在20ppm氨气暴露后发生显著上调（P＜0.05）。以上结果表明氨气诱导活性氧产生,较低浓度下可激活PKC-NRF2-HO-1氧化应激信号通路进行抗氧化反应,但在高浓度下,过多的活性氧不能被有效清除,导致细胞DNA损伤加剧。3.不同浓度氨暴露下仔猪肺部炎症反应相关基因表达检测结果由于氧化损伤常常伴随着炎症反应的发生,因此我们选取促炎基因IL-6、NF-κB（P65）和抗炎基因IL-10、IL-13进行基因表达水平检测,验证仔猪肺组织是否发生了炎症反应。q PCR检测结果发现,相比于对照组,促炎因子IL-6在20ppm氨气暴露30天出现显著上调（P＜0.05）,NF-κB（P65）基因在氨暴露后发生显著下调（P＜0.05）,抗炎因子IL-10和IL-13在20ppm和50ppm氨气刺激后发生显著（P＜0.05）或一定程度的下调。进一步对NF-κB（P65）进行蛋白定量。WB结果显示,NF-κB（P65）蛋白在20ppm组显著上调（P＜0.05）,50ppm组显著下调（P＜0.05）。以上结果表明,20ppm氨气暴露下肺组织可能发生了早期炎症反应,主要以促炎反应为主,而在50ppm氨气暴露下可能发生了晚期炎症反应,即组织的损伤和修复。4.不同浓度氨暴露下肺表面活性蛋白基因表达规律研究结果上述研究结果表明,氨暴露可诱导AECⅡ的损伤,而AECⅡ一个重要的功能就是合成和分泌表面活性蛋白,以维持肺泡表面张力和参与免疫防御。因此我们对肺组织中两种主要的肺表面活性蛋白SP-A1和SP-D的基因表达进行了检测。q PCR和WB结果显示,与对照组相比,20ppm氨气暴露后,SP-A1和SP-D基因mRNA和蛋白表达模式一致,分别发生了极显著（P＜0.01）和显著上调（P＜0.05）;50ppm氨气暴露后,SP-A1基因mRNA表达发生显著上调（P＜0.05）,SP-D基因未发生显著性变化;但SP-A1和SP-D蛋白表达都发生显著性下调（P＜0.01）。通过建立氨气刺激的A549细胞模型,对细胞损伤和表面活性蛋白基因表达规律进行进一步研究。结果发现,与对照组相比,低浓度（20mmol/L）和高浓度（40mmol/L）NH4Cl均可导致A549细胞凋亡,细胞毒性极显著上升（P＜0.01）;高浓度NH4Cl导致DNA和脂质氧化损伤显著增加（P＜0.05）。使用免疫荧光共定位试验对SP-A1和SP-D蛋白转运过程进行检测,发现高浓度NH4Cl刺激A549细胞36h后蛋白转运受阻。表明高浓度氨暴露可能通过阻碍蛋白转运过程影响表面活性蛋白的分泌。结论和意义:本研究发现氨气长期暴露呼吸道,可诱导仔猪肺部发生氧化应激和炎症反应,导致肺泡上皮细胞坏死和肺间质增厚等损伤现象。而具有免疫功能和降低肺泡表面张力的表面活性蛋白在低浓度氨气暴露下被诱导,高浓度氨气暴露下被抑制。研究结果可为进一步解析氨气毒性机理提供理论依据。