【摘 要】
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乙型脑炎病毒（JEV）是一种嗜神经性人兽共患传染病的病原,其主要通过蚊虫进行传播。该病毒感染人,可侵袭中枢神经系统并引发严重的病毒性脑炎;感染猪,可导致种猪发生繁殖障碍以及出现新生仔猪脑炎。诱导中枢神经系统的“炎症风暴”是乙型脑炎病毒感染后最主要的病理特征,但其诱导神经炎症反应的调控机制尚待深入解析。研究表明,组蛋白甲基化修饰在神经炎症性疾病的发病进程中发挥重要作用。组蛋白甲基转移酶EZH2介导的
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乙型脑炎病毒（JEV）是一种嗜神经性人兽共患传染病的病原,其主要通过蚊虫进行传播。该病毒感染人,可侵袭中枢神经系统并引发严重的病毒性脑炎;感染猪,可导致种猪发生繁殖障碍以及出现新生仔猪脑炎。诱导中枢神经系统的“炎症风暴”是乙型脑炎病毒感染后最主要的病理特征,但其诱导神经炎症反应的调控机制尚待深入解析。研究表明,组蛋白甲基化修饰在神经炎症性疾病的发病进程中发挥重要作用。组蛋白甲基转移酶EZH2介导的组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）与炎症反应调控密切相关,但其在调控JEV感染介导的神经炎症中是否也发挥作用,及其机制又如何等科学问题仍不清楚。因此,本研究以JEV为研究对象,探索EZH2介导的组蛋白H3K27的三甲基化在JEV引起神经炎症反应中的调控作用,具体内容如下:1.JEV感染上调H3K27三甲基化的水平将JEV P3株分别感染小胶质细胞（BV2）与小鼠原代胶质细胞（PM）,然后通过Western Blot方法检测JEV感染后H3K27me3的水平。结果发现,JEV感染可以诱导H3K27me3的水平显著上调。在此基础上,采集JEV P3株感染的小鼠脑组织,通过Western Blot检测活体水平上H3K27me3的水平与JEV感染之间的关系。结果表明,JEV感染,同样可以诱导鼠脑组织中H3K27me3水平的显著升高。上述体外体内实验说明,JEV感染可以上调H3K27三甲基化的水平。2.EZH2通过H3K27me3修饰正调控JEV诱导的神经炎症反应为了进一步分析JEV上调H3K27me3的作用机制,我们将JEV分别感染BV2细胞和小鼠原代胶质细胞,然后通过q RT-PCR和Western Blot方法检测特异性调控H3K27me3的甲基转移酶EZH2的表达水平。从结果中发现:EZH2的水平有略微上调,且没有同H3K27me3变化明显。接下来,我们运用CRISPRCas9技术构建了EZH2基因的敲低的BV2细胞系,将JEV感染该细胞系后,利用Western Blot检测EZH2减少对H3K27me3水平的影响,结果发现,EZH2敲低后H3K27me3水平显著下调,证明EZH2确实可以调控JEV上调H3K27me3这一反应。接下来我们探究了EZH2通过H3K27me3修饰对JEV诱导神经炎症的影响,利用q RT-PCR检测上述构建的EZH2敲低细胞系中JEV诱导炎症因子表达情况。结果表明:EZH2敲低后,JEV对H3K27me3水平的上调作用明显减弱,且JEV诱导的炎症因子的水平也明显降低。为了进一步证明该结果,我们使用EZH2特异性抑制剂GSK-343处理BV2细胞和小鼠原代胶质细胞,然后感染JEV并利用q RT-PCR、Western Blot方法检测H3K27me3的水平和炎症因子的表达情况,结果发现:EZH2特异性抑制剂GSK-343能够显著抑制JEV促进的H3K27me3的水平,并可以抑制炎症因子的表达水平。上述实验表明:EZH2通过H3K27me3修饰对JEV引发的神经炎症反应起正调控的作用。3.EZH2介导的H3K27me3通过修饰RNF19A调控JEV诱导的炎症反应为深入揭示H3K27me3调控JEV诱导炎症反应的分子机制,我们通过Ch IPseq发现JEV感染后RNF19A基因对应的H3K27me3水平显著上调。通过进一步验证与功能分析,我们猜测RNF19A的高水平H3K27me3修饰作用可能与JEV介导的神经炎症反应有关联。实验证明,当EZH2被敲低,RNF19A的H3K27三甲基化修饰水平与RNF19A的m RNA水平也随之降低,证明了EZH2介导的H3K27me3通过甲基化修饰RNF19A从而导致其转录被抑制。同时,我们通过在细胞水平上抑制和过表达RNF19A,发现RNF19A被抑制后可以促进JEV诱导的炎症反应;而过表达RNF19A时,可以显著抑制JEV诱导的炎症反应。上述实验表明:EZH2介导的H3K27me3通过修饰RNF19A,进而调控JEV诱导的炎症反应。综上所述,本研究首次证明了组蛋白甲基化修饰在JEV感染过程中调节神经炎症反应的作用,揭示了JEV通过调控宿主基因RNF19A对应的H3K27me3水平促进神经炎症反应,为阐明JEV致病的分子机制提供了新的线索,并为乙型脑炎等病毒性脑炎的治疗提供了新的思路。
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