菊苣酸提取纯化方法及体外吸收机制研究

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:danielliang
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菊苣酸为天然药物紫锥菊中有效成分酚酸类化合物,随着菊苣酸药理作用研究的深入,越来越多的作用被人们熟知,相关资料表明,菊苣酸可以通过肠道吸收,但其吸收率很低如何更高效的让人体吸收菊苣酸,引发了研究者们的浓厚兴趣,通过对菊苣酸稳定性的研究,了解到其在肠道内被吸收,但其吸收机制尚不清晰,本文对其在肠道内吸收机制进行了研究。
  本文研究的目的是通过对紫锥菊根部进行菊苣酸的提取及纯化,并筛选出最优提取方法,并研究菊苣酸的体外吸收机制。本文的主要工作可分为三部分,主要内容及结果如下。
  首先是菊苣酸提取工艺研究。以菊苣酸得率为指标,紫锥菊根粉末(80目)为原料,乙醇为提取溶剂进行超声辅助提取,考查溶剂浓度、温度、时间、次数以及料液比等因素对得率的影响。通过单因素试验选取试验参数,再在单因素基础上,选择溶剂浓度(30%、40%、50%),提取温度(60℃、70℃、80℃),提取时间(1h、2h、3h),料液比(1∶12、1∶15、1∶18)四个因素三个水平设计进行正交试验,以获得其最佳提取工艺。
  其次菊苣酸纯化方法研究。采用葡聚糖凝胶LH-20柱色谱分离技术,将粗提物进一步纯化,得到菊苣酸单体。将菊苣酸单体作为模版分子,4-乙烯基吡啶为功能单体,乙二醇二甲基烯酸酯为交联剂,制备菊苣酸分子印迹聚合物,并应用此分子印迹聚合物为固定相,对紫锥菊根提取物进行富集纯化。
  最后是菊苣酸体外吸收机制研究。通过培养Caco-2细胞,种植细胞在Transwell板上,培养使其分化成致密的,紧密连接的细胞单层,建立Caco-2细胞模型,对模型的跨膜电阻值进行测定,评价模型是否建立成功。再对菊苣酸采用MTT法做细胞毒试验,通过测定每孔在490nm下的光密度(OD)值,计算细胞增值率,增值率高于80%认定为对细胞无任何毒性,确定无细胞毒性的菊苣酸浓度,再选用不同浓度(100μM、200μM、500μM)菊苣酸进行Transwell试验,选定900s、1800s、2700s、3600s、5400s、7200s、10800s时间点,将各个点的样品经UPLC检测后,做出药时曲线,计算Papp值和外排率(Er)值,确定其吸收情况。按照同样的方法再对壳聚糖,谷胱甘肽和维拉帕米进行细胞毒试验,分析安全有效的给药浓度,选择加入浓度进行Transwell试验,确定药时曲线计算P app值和Er值,分析EDTA和壳聚糖有没有存在细胞旁通路的转运,分析pH、维拉帕米和谷胱甘肽等因素来推测出菊苣酸是如何参与转运的,最终分析菊苣酸转运机制。
  结果显示:1、用50%浓度的乙醇在70℃下采用1∶18的料液比,超声辅助提取2h,按照最优条件提取得到菊苣酸得率为1.89mg/g。2、经葡聚糖凝胶LH-20提取分离后,高效液相色谱法测定菊苣酸含量为90.22%。紫锥菊根粉经分子印迹聚合物富集纯化后,可同时富集母核结构相同的菊苣酸和咖啡酸。3、菊苣酸可能是通过以被动转运为主,主动转运协同的转运机制,确定EDTA和壳聚糖均可以不同程度的提高累积转运量,证实菊苣酸的转运有被动运输参与,谷胱甘肽转移酶和Na+通道参与菊苣酸的转运,P-gP则在转运中不发挥作用,pH也可能影响菊苣酸转运。
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