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第一部分喉癌前病变及微浸润癌临床病理研究
背景与目的:
喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,尽管目前其预防、监测、手术治疗和放射治疗方法不断发展,但近二十年来晚期喉癌患者的五年生存率并无明显提高,而且,晚期喉癌的全喉切除给患者留下功能障碍,严重影响患者的生活质量。因此,对喉癌前病变及微浸润癌的早期诊断和及时治疗将对改善患者预后、提高生存质量具有重要意义。
目前国际上对喉癌前病变及微浸润癌诊断标准的认识尚未达到统一,名称也较繁杂。由于应用不同的分级诊断方案,可能会影响临床对患者的处理方式出现不同程度的差异,对患者的随访方案及其预后评估形成不同的结果,从而影响到患者的生活质量、病程经过、预后和最佳治疗效果。本研究通过对204例喉癌前病变和76例微浸润癌病例进行回顾性临床病理分析,旨在增进和丰富对喉癌前病变及微浸润癌的认识,分析病理论断中存在的主要困难之处及其原因,并通过免疫组化染色方法对Ⅳ型胶原、P53、Ki-67、E-cad、CD44V6、Survivin和PTEN蛋白的检测和观察,分析与喉癌发生发展相关的多个基因蛋白在癌变不同阶段的表达状况及与病理分级诊断结果之间的相关性,探讨喉癌前病变的分子机制和癌变的早期分子事件,为喉癌前病变及微浸润癌的准确诊断及合理治疗提供进一步的科学依据。
材料与方法:
1.临床病理学特征
收集首都医科大学附属北京同仁医院2002年1月至2009年12月诊断的喉癌前病变及微浸润癌初治患者280例,查阅病例资料确定患者的性别、年龄、职业、烟酒嗜好、临床表现、频闪喉镜结果。根据病理号查阅相应的病理资料,显微镜下观察病理切片。总结其临床及病理组织学特征。
2.免疫组化染色
收集存档组织蜡块197例,包括轻度异型增生31例、中度异型增生27例、重度异型增生18例、原位癌26例、微浸润癌30例、浸润癌45例(高分化、中分化、低分化各15例)。喉癌旁正常粘膜组织对照组为20例,为2002年1月至2009年12月本病理室存档蜡块。所有患者之前均未接受过化疗和放疗,并均经病理证实。用免疫组织化学方法检测Ⅳ型胶原、P53、Ki-67、CD44V6、E-cadherin、Survivin、PTEN蛋白的表达,对比分析它们在各组病变中的差异。
结果:
1.喉癌前病变及微浸润癌患者中男女之比约为8.66:1,男性患者发病率明显高于女性。40岁以上的患者比例增多,其中50-59岁年龄段发病率最高。吸烟、饮酒与之关系密切。工人患病率最高,比例为33.21％。病变部位以单侧声带受累为主,占所有患者的83.93％。临床症状以声音嘶哑最为常见,占所有患者的81.43％。轻度异型增生患者主要表现为声带黏膜波轻度减低,随黏膜异型增生程度的增加,声带黏膜波表现为中度减低、重度减低甚至完全消失,在原位癌和微浸润癌更为明显。不同分组的声带黏膜波差异有统计学意义(P<0.001)。
2.各级别喉癌前病变及微浸润癌的肉眼观相似,常表现为声带充血,膨出粗糙肿物,表面粗糙不平,白色斑片样物附着。镜下喉癌前病变、原位癌及微浸润癌其病理形态学改变较复杂,部分区域各级形态学改变类似于宫颈上皮的非典型增生或癌变,称之为Ⅰ型异型增生或癌变；绝大部分则为伴不全角化的异型上皮呈内翻性增生,并在此基础上发生癌变,称之为Ⅱ型异型增生及癌变,但癌变及微浸润的判定常比较困难。
3.免疫组织化学染色:①阳性部位:Ⅳ型胶原蛋白阳性定位于基底膜；P53、Ki-67、Survivin蛋白阳性定位于细胞核；E-cad、CD44V6蛋白阳性定位于细胞膜；PTEN蛋白阳性定位于细胞浆和/或细胞核。②七种基因蛋白在喉不同病变组织中的表达:从正常喉上皮-轻度异型增生-中度异型增生-重度异型增生-原位癌-微浸润癌-浸润癌的发展过程中,Ⅳ型胶原、E-cad、CD44V6、PTEN蛋白的阳性表达率呈逐渐降低趋势(P<0.001),P53、Ki-67、Survivin蛋白的阳性表达率呈逐渐升高趋势(P<0.001)。
结论:
1.喉癌前病变及微浸润癌多见于中老年男性患者,与吸烟、饮酒密切相关。工人患病率最高,病变部位以单侧声带受累为主,临床表现以声音嘶哑最为常见。频闪喉镜可为喉癌前病变及微浸润癌提供一种简便有效的临床辅助检测手段,并通过相应的组织病理学分析,为喉部疾病的准确诊断及治疗提供较好的参考依据。
2.喉癌前病变异型增生主要表现为Ⅱ型异型增生,Ⅱ型重度异型增生、原位癌、微浸润癌的鉴别诊断难度较大,缺乏客观性的检测指标,细致广泛的取材、全面的组织学观察对于发现病变和确定诊断将非常重要。
3.Ⅳ型胶原、P53、Ki-67、CD44V6、E-cadherin、Survivin、PTEN蛋白具有早期预警意义,可以作为喉癌前病变及微浸润癌早期检测指标,对临床病理具有辅助诊断作用。
第二部分 hTERC和C-MYC基因在喉癌变过程中的表达及其意义
背景:
目前,喉癌前病变的诊断主要依靠病理形态学检查,由于喉癌前病变的形态学变化比较复杂多变,缺乏客观性较强的诊断标准,因此,其病理论断在不同病理学家之间常常出现不同程度的差异。故深入了解喉癌变过程中的相关因素,包括寻找喉癌变过程中的相关分子标志物,将可能有助于喉癌前病变及微浸润癌的病理论断。
研究表明,人类大多数恶性肿瘤的发生发展常与染色体的不稳定性有关。用比较基因组杂交技术对头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cellcarcinoma,HNSCC)基因组不稳定性进行研究表明,HNSCC中存在3q,8q,9q,20q,7p,11q13及5p上基因的扩增,以及3p,9p,21q,5q,13q,18q和8p上基因缺失等多个染色体多种基因异常。其中3q和8q扩增是最常见的染色体异常之一,涉及到的最重要的基因可能是人端粒酶RNA(human telomerase RNAcomponent,hTERC,位于3q26.3)基因和C-MYC基因(位于8q24)。
hTERC基因位于3q26.3,其主要作用是编码端粒酶复合物中RNA成分,该成分为合成端粒重复序列的模板,是端粒酶活性必需的核心组分之一。端粒酶是由RNA和蛋白质亚基组成的核糖核蛋白复合物,以自身RNA组分为模板、蛋白质组分具有催化活性的逆转录酶,合成人的端粒重复序列(TTAGGG)n,维持端粒长度,其活性被认为与癌细胞的永生化有关。研究表明hTERC基因的扩增可以阻止细胞凋亡,从而导致肿瘤产生。
C-MYC基因位于8q24,是Myc基因家族的重要一员。C-MYC基因参与细胞增殖、分化和程序性细胞死亡,编码的helix—loop-helix/亮氨酸拉链的蛋白质在转录过程中同时具有激活和抑制作用。C-MYC基因主要通过扩增、基因重排、核型不稳定的方式激活。
hTERC基因与C—MYC基因与其他肿瘤的相关性已有研究,但hTERC基因与C—MYC基因与喉癌变发生发展过程中的作用尚未明确。
目的:
利用FISH技术检测不同级别异型增生在喉癌变过程hTERC基因与C-MYC基因的表达情况,探讨hTERC与C-MYC基因在喉癌发生、发展过程中的作用及其临床意义,探讨hTERC、C-MYC作为喉癌前病变早期诊断标志物的可行性,为喉癌前病变的诊断提供更为准确、可靠、更有预见性的新方法。
方法:
1.以108例喉组织标本为检测对象,其中正常喉黏膜组织14例、轻度异型增生15例、中度异型增生18例、重度异型增生16例、原位癌9例、微浸润癌15例及浸润癌21例,应用FISH方法检测七种不同组织标本中的hTERC基因的扩增情况。
2.以108例喉组织标本为检测对象,应用FISH方法,检测上述七种不同组织标本中C-MYC基因的易位和扩增情况。
结果:
1.108例喉组织标本中,正常、轻度、中度、重度异型增生、原位癌、微浸润癌及浸润癌组织的hTERC基因扩增阳性率分别为:0.00％(0/14)、13.33％(2/15)、72.22％(13/18)、81.25％(13/16)、100％(9/9)、100％(15/15)、100％(21/21)。不同病变组,TERC基因扩增阳性率有显著差异(P<0.0001),随病变程度加重,TERC基因扩增阳性率显著增高。hTERC基因在正常组与轻度异型增生组未见明显扩增,而在中度异型增生及以上病变组中出现明显扩增(P<0.0001)。
2.108例喉组织标本中均未见C—MYC易位。正常、轻度、中度、重度异型增生、原位癌及浸润癌组的C-MYC基因扩增的阳性率分别为:0.00％(0/14)、0.00％(0/15)、11.12％(2/18)、18.75％(3/16)、22.22％(2/9)、46.67％(7/15)57.14％(12/21)；C-MYC基因拷贝数增加的阳性率分别为14.29％(2/14)、46.67％(7/15)、55.56％(10/18)、87.50％(14/16)、88.89％(8/9)、100％(15/15)、100％(21/21)；C-MYC基因扩增、C-MYC基因拷贝数增加的阳性率随病理改变级别的升高而增高(P<0.0001),而C-MYC基因获得的阳性率任意两组之间无显著差异(P>0.05)。
结论:
1.hTERC基因在喉癌前病变和喉癌中有不同程度的表达,随病变程度增加,其hTERC基因阳性表达率增加。提示hTERC基因异常扩增是喉癌形成的早期事件,并伴随喉癌性病变的始终。hTERC基因可能作为喉癌前病变和喉癌的分子标志物之一,成为喉癌前病变诊断、病情监测的辅助指标。
2.C-MYC基因在喉癌前病变和喉癌的激活方式主要以扩增为主。C-myc基因在喉癌前病变和喉癌中有不同程度的表达,随病变程度增加,其阳性表达率增加。提示C-MYC基因的扩增和拷贝数增加是部分异型增生细胞异常增生的原因或促进因素,是喉上皮细胞向恶性转化的标志之一,C-MYC基因的扩增水平有可能成为喉癌前病变临床病理分子诊断和检测喉癌前病变是否有恶变倾向的一种参考指标。
3.FISH检测方法操作简便、快速；探针稳定性好；敏感性和特异性较强；可应用于石蜡组织切片的检测;FISH检测方法可用于寻找分子遗传学标志物,在辅助临床病理论断方面可能具有一定的临床应用前景。