论文部分内容阅读
GRAS蛋白是一类植物特有的转录因子，广泛参与了植株发育、分生组织维持、根辐射形态建成、光信号转导、植物激素信号转导和胁迫响应等生理过程。目前，对该基因家族成员的鉴定工作已相继在拟南芥、水稻、杨树、大白菜、松树、果梅和葡萄等几个物种完成。然而大部分 GRAS蛋白的功能尚未阐明。基于此，本论文主要利用重要果实模式作物番茄为材料，全面鉴定和分析了该物种 GRAS家族成员并对其中一个受小RNA(miR171)调控的基因SlGRAS24的功能进行了深入研究，主要完成了以下几方面的工作： ①在番茄中共鉴定出53个GRAS基因家族成员，其中19个已经在NCBI中存在命名信息（SlLS），另34个成员根据其基因序列在番茄染色体的位置信息分别命名为 SlGRAS18-SlGRAS51；多序列比对显示大多数SlGRAS蛋白C端具有典型的GRAS结构域。通过和拟南芥、水稻、杨树、梅中 GRAS成员一起的系统发育树分析表明该家族一共分为13个亚家族；5’-RACE实验表明其中两个成员为miR171的靶基因：即SlGRAS24和SlGRAS40；运用qRT-PCR技术，分析了各成员在番茄中各组织器官中组织表达模式，同时分析了各成员在各激素处理和非生物胁迫条件下的响应情况； ②SlGRAS24超表达转基因番茄植株表现出植株矮化，叶片变小，开花延迟，腋芽异位，根抑制，座果率降低等多重表型；qRT-PCR和SlGRAS24启动子GUS融合表达转基因番茄(pSlGRAS24::GUS)的组织化学染色分析结果均显示出SlGRAS24在番茄营养器官和生殖器官中的特异性表达； ③启动子序列分析显示SlGRAS24启动子区含有赤霉素和生长素响应原件，外源 GA3或 IAA处理野生型番茄和 pSlGRAS24::GUS转基因番茄幼苗均表明SlGRAS24的明显响应；SlGRAS24超表达幼苗中大多数赤霉素和生长素相关基因均下调，且这些基因对GA3或IAA的响应情况具有不同程度的改变；HPLC-MS/MS结果表明SlGRAS24超表达番茄籽苗中内源GA3和IAA呈显著增加；激素敏感性实验进一步表明SlGRAS24同时参与了赤霉素和生长素信号路径； ④花粉互交实验、TCC花粉染色实验和花器官组织学切片分析表明SlGRAS24超表达植株中果实座果率低，果实和种子发育被抑制主要是由于SlGRAS24超表达造成花粉发育异常所引起；同时对野生型和转基因盛花RNA-seq测序分析发现数个花粉发育、激素信号转导相关基因和转录因子的表达变化；对果实初期发育不同时间果皮切片观察和相关基因的定量分析表明，SlGRAS24超表达植株果实细胞的分裂和伸长均受到抑制。 综上，该论文首次全面分析了重要果实作物番茄中GRAS转录因子家族成员及其表达情况，这为我们深入了解GRAS家族基因的进化特征，鉴定GRAS家族基因的生理功能具有重要意义，也为以后利用基因工程手段改良番茄或者其他茄科作物的农业性状提供了基因资源。此外，通过转基因株系的表型观察和分析，发现该家族成员 SlGRAS24参与了生长素-赤霉素两种植物激素的互作，且在番茄晚期雄蕊发育过程中起重要作用，加深了我们对这两种生理过程的分子机制的认识。