【摘 要】
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酵母双杂交系统是目前研究蛋白质相互作用的重要手段之一,此方法具有高灵敏度、相对简单、快捷及不经蛋白纯化即可获得蛋白编码区的优点。近年来,酵母双杂交技术在研究蛋白质
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酵母双杂交系统是目前研究蛋白质相互作用的重要手段之一,此方法具有高灵敏度、相对简单、快捷及不经蛋白纯化即可获得蛋白编码区的优点。近年来,酵母双杂交技术在研究蛋白质相互作用、筛选新蛋白、研究蛋白功能等方面发挥了重要作用。
肌球蛋白X(Myosin X,Myo X)是仅表达于脊椎动物中的非传统肌球蛋白,其尾部的MYTH4和FERM结构域可与多种功能蛋白相结合。这些蛋白与丝足的形成、神经元的突起生长与投射、内皮细胞的迁移、细胞的粘附及有丝分裂中纺锤体的形成等过程密切相关。因此Myo X在脊椎动物细胞中发挥了重要作用。
为了进一步深入的研究Myo X在脊椎动物体内的作用,本研究利用酵母双杂交技术,以Myo X的尾部结构域中的MYTH4和FERM结构为诱饵,对人胎脑cDNA文库进行了筛选。实验经Leu、Trp、His、Ade四种氨基酸营养缺陷型培养基筛选以及β-半乳糖苷酶活性分析,共获得112个阳性克隆,经过反复传代四种氨基酸营养缺陷型培养基筛选和β-半乳糖苷酶活性分析,去除一个酵母菌株中含有两个cDNA文库质粒的可能,再经过回交实验验证,最大程度的保证了酵母双杂交结果的准确性。从酵母菌株中提取质粒,转入大肠杆菌中,以氨苄青霉素(Amp)抗性筛选靶质粒,对部分阳性克隆的插入片段进行测序,在GENE BANK进行比对后分类,从分类结果可知与Myo X相互作用的蛋白涉及参与细胞迁移蛋白、细胞骨架蛋白、参与物质运输蛋白、参与基因表达调节的蛋白、参与信号转导蛋白等,为深入了解MyoX在生理上的新功能奠定基础。
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