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水通道蛋白(AQPs)是细胞膜上特异性转运水的孔道。之前的研究表明AQPl普遍表达于肿瘤血管内皮,并且在其他的许多肿瘤细胞中也有表达。但是,其表达是否是一种异常现象,或者其在肿瘤生物学中是否为关键因素,这些在AQPs的表达研究中仍不清楚。
对于水通道蛋白1(AQP1)的研究历史短暂,现在对于它的研究还不能完全表明其在机体内的作用机制。本研究构建AQP1的shRNA的腺病毒质粒,并利用AQP1-shRNA重组腺病毒质粒干涉内源性表达的AQP1及外源性表达的AQP1,研究了AQP1和细胞水转运功能和细胞运动性之间的关系。
首先采用包括入门载体pENTR2B和目的载体pAd／CMVN5-DEST在内的腺病毒载体系统,并利用DNA重组技术以及LR反应构建AQP1-shRNA重组腺病毒质粒,再使用双抗生素筛选、不同感受态细胞转化筛选以及限制性内切酶酶切鉴定其正确性。
然后将分子水平鉴定正确的AQP1-shRNA重组腺病毒质粒转染到表达外源性AQP1的CHO细胞以及表达内源性AQP1的肝癌细胞SMMC7221中,并通过Western blot实验和免疫荧光实验对AQP1-shRNA重组腺病毒质粒进行功能鉴定,结果证明AQP1-shRNA重组腺病毒质粒不仅可以沉默外源性的hAQP1还可以沉默内源性hAQP1基因表达,并且以第二个质粒即hAQP1-shRNA2沉默效果最为显著。
之后利用MTT实验、细胞膜水通透性实验、划痕实验以及Western blot实验研究转染AQP1-shRNA重组腺病毒质粒后通过沉默外源性AQP1以及内源性AQP1表达进而研究AQP1和细胞水转运功能以及细胞运动性的关系,结果说明AQP1-shRNA重组腺病毒质粒既可以显著干涉CHO细胞中外源性AQP1对水的通透性,又可以干涉肝癌细胞SMMC7221中内源性糖基化的AQP1对水的通透性,并且AQP1-shRNA重组腺病毒质粒沉默AQP1后,细胞运动性受到显著地抑制,同时AQP1可能通过细胞骨架的重建修复来参与细胞的运动。