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背景：
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是全球导致死亡的主要原因之一，随着医疗健康水平的提高，其发病率仍在继续上升，严重威胁人类健康。在缺血后重新得到血液再灌注是救治的关键，但在恢复血流一段时间内发生的血压下降、心功能障碍等现象，不仅不能使心脏功能恢复，反而加重心脏的功能障碍和结构损伤，即心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。有研究指出，再灌注损伤导致的心肌损伤占血流恢复后的心肌总损伤的50%以上。探索和发现有效干预新策略和药物作用新靶点是本领域全球高度关注和亟待解决的热点、难点科学问题。RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)是一项对疾病前后差异基因进行广泛筛选的技术手段，目前在各类临床和基础研究中均已得到应用。蛋白galectin-3是一类具有独特嵌合体结构的半乳糖凝集分子，广泛表达于各种类型的组织和细胞中，发挥了重要的生物学功能，并在多种心血管疾病如心肌重构、心肌纤维化中都有显著升高，并发挥重要作用，但其在心肌I/R损伤中的作用目前并不清楚。
目的：
1.寻找在心肌I/R损伤中起关键调控作用的基因，并从细胞和整体动物水平对其进行验证。
2.通过多种药理学手段，深入研究Galectin-3对心肌I/R损伤的影响及机制。
实验方法：
1.目标分子筛选及确定
C57BL/6J小鼠，随机分为Sham组和心肌I/R组，I/R组采用结扎小鼠左冠状动脉法行心肌I/R(30 min/24 h)损伤,Sham组行假手术。①RNA-seq检测小鼠心肌危险区(area at risk, AAR)差异表达基因。通过比对全基因组测序结果，GO分析等方法筛选目的基因；②免疫组化染色法检测AAR区galectin-3蛋白表达；③建立HL-1心肌细胞缺氧复氧(hypoxic reoxygenation, H/R)(12 h/1 h)损伤模型，WesternBlot法检测其galectin-3蛋白表达。
2.Galectin-3在心肌I/R损伤中的作用
C57BL/6J小鼠给予不同剂量的galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin(i.p. 3 days, qd)或结合肽G3-C12(i.p. 3 days, qd)，行心肌I/R损伤。①小动物心脏超声系统检测心脏功能，实时采集超声心动图像和视频，通过计算射血分数(ejection fraction, EF)和缩短分数(fractional shortening, FS)评价心功能；②心脏组织切片伊文氏蓝和TTC双染色法检测小鼠心肌梗死面积；③石蜡切片HE染色观察心肌形态和炎症细胞浸润；④石蜡切片TUNEL法检测AAR区心肌组织细胞凋亡。
3.Galectin-3对H/R损伤所致线粒体功能紊乱的作用
不同浓度的galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin或结合肽G3-C12预处理HL-1细胞40min，行H/R损伤。①台盼蓝染色测定细胞存活比例；②比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)含量；③JC-1染色检测HL-1心肌细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)变化；④比色法检测HL-1心肌细胞线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)变化；⑤可见分光光度计测定HL-1心肌细胞MDA含量与SOD活性；⑥WesternBlot法检测心肌细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。
实验结果：
1.Galectin-3在心肌I/R损伤后显著升高，并可能发挥重要作用
①RNA-seq实验结果表明，心肌I/R损伤后，与Sham组比，有724个基因上调，162基因下调；GO分析表明，筛选得到的差异基因中Lgals3(上调21.98folder)在“生物过程”、“细胞组成”、“分子功能”三个子集取得交集中变化最为显著，推测其所编码的galectin-3蛋白可能在心肌I/R损伤中发挥重要作用；②免疫组化结果表明，心肌I/R损伤后，galectin-3蛋白表达发生显著增加；③WesternBlot结果表明，H/R损伤后，galectin-3蛋白表达显著增加。
2.Galectin-3抑制剂显著减轻心肌I/R损伤
①超声检测分析显示，galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(2.5, 5.0 mg/kg)显著增加I/R损伤后EF和FS值；②伊文氏蓝和TTC双染色结果表明，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(5.0 mg/kg)显著减少I/R所致心肌梗死面积；③HE染色结果表明，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(5.0 mg/kg)显著降低I/R所致心肌损伤评分。④TUNEL结果显示，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(1.0, 2.5, 5.0 mg/kg )显著减小I/R所致心肌AAR区细胞凋亡。
3.Galectin-3抑制剂显著改善H/R损伤所致线粒体功能紊乱
①台盼蓝染色结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著增加HL-1细胞H/R损伤后存活比例；②比色法检测结果表明，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著降低HL-1细胞H/R损伤后LDH含量；③JC-1染色结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(25,50μM)显著升高HL-1细胞H/R损伤后MMP水平；④可见分光光度计测定结果表明，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著降低H/R损伤后MDA含量并提高SOD活性；⑤WesternBlot检测结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(25,50μM)显著逆转H/R损伤所致HL-1细胞细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达变化。
结论：
1.Lgals3基因编码的galectin-3蛋白在心肌I/R损伤后显著上调，在GO分析的“生物过程”、“细胞组成”、“分子功能”三个子集中均发挥重要作用。
2.抑制galectin-3可减轻心肌I/R损伤，显著增加I/R损伤后EF和FS值，减少I/R所致心肌梗死和细胞凋亡，增加H/R损伤后细胞存活比例，降低H/R损伤后LDH释放含量，减小过度氧化应激损伤。
3.抑制galectin-3能改善心肌I/R损伤所致线粒体功能紊乱，显著升高H/R损伤所致MMP降低，减少线粒体膜通透性增加，增加细胞线粒体CRC，维持线粒体功能稳态。
4.抑制galectin-3可显著逆转H/R损伤所致HL-1细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达变化。
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是全球导致死亡的主要原因之一，随着医疗健康水平的提高，其发病率仍在继续上升，严重威胁人类健康。在缺血后重新得到血液再灌注是救治的关键，但在恢复血流一段时间内发生的血压下降、心功能障碍等现象，不仅不能使心脏功能恢复，反而加重心脏的功能障碍和结构损伤，即心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。有研究指出，再灌注损伤导致的心肌损伤占血流恢复后的心肌总损伤的50%以上。探索和发现有效干预新策略和药物作用新靶点是本领域全球高度关注和亟待解决的热点、难点科学问题。RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)是一项对疾病前后差异基因进行广泛筛选的技术手段，目前在各类临床和基础研究中均已得到应用。蛋白galectin-3是一类具有独特嵌合体结构的半乳糖凝集分子，广泛表达于各种类型的组织和细胞中，发挥了重要的生物学功能，并在多种心血管疾病如心肌重构、心肌纤维化中都有显著升高，并发挥重要作用，但其在心肌I/R损伤中的作用目前并不清楚。
目的：
1.寻找在心肌I/R损伤中起关键调控作用的基因，并从细胞和整体动物水平对其进行验证。
2.通过多种药理学手段，深入研究Galectin-3对心肌I/R损伤的影响及机制。
实验方法：
1.目标分子筛选及确定
C57BL/6J小鼠，随机分为Sham组和心肌I/R组，I/R组采用结扎小鼠左冠状动脉法行心肌I/R(30 min/24 h)损伤,Sham组行假手术。①RNA-seq检测小鼠心肌危险区(area at risk, AAR)差异表达基因。通过比对全基因组测序结果，GO分析等方法筛选目的基因；②免疫组化染色法检测AAR区galectin-3蛋白表达；③建立HL-1心肌细胞缺氧复氧(hypoxic reoxygenation, H/R)(12 h/1 h)损伤模型，WesternBlot法检测其galectin-3蛋白表达。
2.Galectin-3在心肌I/R损伤中的作用
C57BL/6J小鼠给予不同剂量的galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin(i.p. 3 days, qd)或结合肽G3-C12(i.p. 3 days, qd)，行心肌I/R损伤。①小动物心脏超声系统检测心脏功能，实时采集超声心动图像和视频，通过计算射血分数(ejection fraction, EF)和缩短分数(fractional shortening, FS)评价心功能；②心脏组织切片伊文氏蓝和TTC双染色法检测小鼠心肌梗死面积；③石蜡切片HE染色观察心肌形态和炎症细胞浸润；④石蜡切片TUNEL法检测AAR区心肌组织细胞凋亡。
3.Galectin-3对H/R损伤所致线粒体功能紊乱的作用
不同浓度的galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin或结合肽G3-C12预处理HL-1细胞40min，行H/R损伤。①台盼蓝染色测定细胞存活比例；②比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)含量；③JC-1染色检测HL-1心肌细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)变化；④比色法检测HL-1心肌细胞线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)变化；⑤可见分光光度计测定HL-1心肌细胞MDA含量与SOD活性；⑥WesternBlot法检测心肌细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。
实验结果：
1.Galectin-3在心肌I/R损伤后显著升高，并可能发挥重要作用
①RNA-seq实验结果表明，心肌I/R损伤后，与Sham组比，有724个基因上调，162基因下调；GO分析表明，筛选得到的差异基因中Lgals3(上调21.98folder)在“生物过程”、“细胞组成”、“分子功能”三个子集取得交集中变化最为显著，推测其所编码的galectin-3蛋白可能在心肌I/R损伤中发挥重要作用；②免疫组化结果表明，心肌I/R损伤后，galectin-3蛋白表达发生显著增加；③WesternBlot结果表明，H/R损伤后，galectin-3蛋白表达显著增加。
2.Galectin-3抑制剂显著减轻心肌I/R损伤
①超声检测分析显示，galectin-3抑制剂柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(2.5, 5.0 mg/kg)显著增加I/R损伤后EF和FS值；②伊文氏蓝和TTC双染色结果表明，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(5.0 mg/kg)显著减少I/R所致心肌梗死面积；③HE染色结果表明，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(5.0 mg/kg)显著降低I/R所致心肌损伤评分。④TUNEL结果显示，柑橘果胶pectin(1%)和结合肽G3-C12(1.0, 2.5, 5.0 mg/kg )显著减小I/R所致心肌AAR区细胞凋亡。
3.Galectin-3抑制剂显著改善H/R损伤所致线粒体功能紊乱
①台盼蓝染色结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著增加HL-1细胞H/R损伤后存活比例；②比色法检测结果表明，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著降低HL-1细胞H/R损伤后LDH含量；③JC-1染色结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(25,50μM)显著升高HL-1细胞H/R损伤后MMP水平；④可见分光光度计测定结果表明，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(50μM)显著降低H/R损伤后MDA含量并提高SOD活性；⑤WesternBlot检测结果显示，柑橘果胶pectin(0.01%)和结合肽G3-C12(25,50μM)显著逆转H/R损伤所致HL-1细胞细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达变化。
结论：
1.Lgals3基因编码的galectin-3蛋白在心肌I/R损伤后显著上调，在GO分析的“生物过程”、“细胞组成”、“分子功能”三个子集中均发挥重要作用。
2.抑制galectin-3可减轻心肌I/R损伤，显著增加I/R损伤后EF和FS值，减少I/R所致心肌梗死和细胞凋亡，增加H/R损伤后细胞存活比例，降低H/R损伤后LDH释放含量，减小过度氧化应激损伤。
3.抑制galectin-3能改善心肌I/R损伤所致线粒体功能紊乱，显著升高H/R损伤所致MMP降低，减少线粒体膜通透性增加，增加细胞线粒体CRC，维持线粒体功能稳态。
4.抑制galectin-3可显著逆转H/R损伤所致HL-1细胞线粒体cytoC、细胞质cytoC、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达变化。