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目的：
对天津地区骨质疏松性骨折发病率、再骨折风险预测,年龄分布等特征进行观察,了解骨质疏松骨折的发病状况,对髋部脆性骨折患者进行综合干预,评价疗效;在体内和体外水平通过Wnt1sw/sw骨质疏松大鼠模型评估Tan-ⅡA对骨质疏松的治疗效果,从氧化应激角度探讨其抗骨质疏松作用机制.
方法：
第一部分：对天津医院急诊骨折患者进行骨质疏松风险评估,对骨质疏松风险因素做出统计分析.对100例骨松骨折患者进行临床综合干预,从血清P1NP,S-CTX,25(OH)D,VAS评分,SF-36生活问卷等方面等评估综合干预的疗效.
第二部分：将96只雌性Wnt1sw/sw骨质疏松大鼠随机分为3组,每组分别接受Tan-ⅡA,ADN和PBS腹腔内注射(200μl),每日一次.从各实验组分离出成骨细胞,通过RT-qPCR分析Bcl-2,ALP,p53,NF-κB,iNOS,COX2,TRAF-1,TNF-α,Caspase-3,Apaf-1和IAP的水平.提取的成骨细胞在裂解液中离心,上清液中的兴趣蛋白标记后进行免疫荧光分析.获取各组胫骨标本,进行生物力学测试,然后进行免疫组化染色,制成切片.所有切片用辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G联合培养并标记,用免疫荧光显微镜随机观察6个视野.通过流式细胞计数和DCFH-DA法对细胞内氧化应激反应进行评估,并用CellQuest Pro软件进行分析.将成骨细胞在成骨媒介中培养12小时,并确认其分化情况.
结果：
第一部分：(1)随着BMI值的增加,骨质疏松患病率有降低的趋势(2)脊柱骨折占总体骨折的34.64%(1541处),股骨近端骨折占总体骨折的31.21%(1388处),尺桡骨远端骨折占21.58%(960处),肱骨近端骨折占2.57%(559处),女性患者均多于男性.(3)女性患者随着初潮年龄的增加,骨质疏松患病几率呈下降趋势,但差异无明显统计学意义(χ2=1.175,P>0.05).(4)吸烟可能对女性骨质疏松性骨折的发生有促进作用.(5)骨质疏松症患者合并内科疾患以高血压最多,糖尿病和风湿免疫性疾病次之.(6)经过骨质疏松骨折的综合治疗,半年后血清P1NP、S-CTX均较术前下降,25(OH)D3轻度上升,但无统计学意义.(7)术后VAS评分及SF-36评分较术后明显改善(P>0.05).
第二部分：(1)Tan-ⅡA能增强成骨细胞的活性,且其存在剂量依赖性,与ASN组和PBS组相比有统计学差异(p<0.05).Tan-ⅡA用药后增加过氧化氢浓度继续培养24小时,依然能观察到成骨细胞的活性增强.从形态学观察发现Tan-ⅡA对破骨细胞的分化具有抑制作用.(2)Tan-ⅡA通过RANKL通路抑制成骨细胞的凋亡,促进破骨细胞的凋亡.在体外实验中Tan-ⅡA组抗凋亡基因Bcl-2和p53的表达水平在成骨细胞中升高,而在破骨细胞中下降(p<0.05).(3)生物力学测试后显示,在刚度、极限强度和弹性模量三个方面TAN-ⅡA组骨组织的力学性能具有明显优势(p<0.05).(4)Tan-ⅡA组脯氨酸/酰胺-Ⅰ,磷酸盐/酰胺-Ⅰ,磷酸盐/脯氨酸的比值最高(p<0.05)表明Tan-ⅡA对骨组织的矿化和细胞外基质的形成具有积极作用.(5)在成骨细胞中Tan-ⅡA组ALP的mRNA表达上调,过氧化氢与氧自由基的的蓄积水平下降,超氧化物歧化酶和硫代巴比妥酸反应物表达水平上调,氧自由基水平明显低于其他两组(p<0.05).可见TAN-ⅡA能抑制成骨细胞因氧化应激作用而产生的不良影响.(6)Tan-ⅡA作用于NF-κB的靶基因(TNF-α,iNOS和COX2)使其表达水平下调,TRAF-1和IAP表达水平上调(p<0.05);P56,ⅠκB和ⅠκB激酶在Tan-ⅡA组同时下调(p<0.05).
结论：
(1)天津地区骨质疏松性骨折患者有以下特征：随着BMI值的增加,骨质疏松患病率有降低的趋势;吸烟可能对女性骨质疏松性骨折的发生有促进作用;骨质疏松症患者合并内科疾患以高血压最多,糖尿病和风湿免疫性疾病次之.(2)脆性骨折中,脊柱骨折最多,其次依次是股骨近端骨折,尺桡骨远端骨折和肱骨近端骨折,女性患者均多于男性.(3)月经初潮年龄对女性患者的骨质疏松患病率影响尚不明确.(4)规范的骨质疏松骨折综合治疗能提高患者的生活质量.(5)利用骨质疏松大鼠为模型,从动物实验到体外细胞培养两个方面观察了Tan-ⅡA对骨细胞的影响及其作用机制.同时对骨细胞活性和破骨细胞分化进行检测来验证Tan-ⅡA对骨质疏松的治疗作用,亦对其介导的信号通路进行分析.试验结果提示Tan-ⅡA对骨质疏松大鼠成骨细胞的氧化应激有抵抗作用,此效果是通过NF-κB信号通路来实现的.
对天津地区骨质疏松性骨折发病率、再骨折风险预测,年龄分布等特征进行观察,了解骨质疏松骨折的发病状况,对髋部脆性骨折患者进行综合干预,评价疗效;在体内和体外水平通过Wnt1sw/sw骨质疏松大鼠模型评估Tan-ⅡA对骨质疏松的治疗效果,从氧化应激角度探讨其抗骨质疏松作用机制.
方法：
第一部分：对天津医院急诊骨折患者进行骨质疏松风险评估,对骨质疏松风险因素做出统计分析.对100例骨松骨折患者进行临床综合干预,从血清P1NP,S-CTX,25(OH)D,VAS评分,SF-36生活问卷等方面等评估综合干预的疗效.
第二部分：将96只雌性Wnt1sw/sw骨质疏松大鼠随机分为3组,每组分别接受Tan-ⅡA,ADN和PBS腹腔内注射(200μl),每日一次.从各实验组分离出成骨细胞,通过RT-qPCR分析Bcl-2,ALP,p53,NF-κB,iNOS,COX2,TRAF-1,TNF-α,Caspase-3,Apaf-1和IAP的水平.提取的成骨细胞在裂解液中离心,上清液中的兴趣蛋白标记后进行免疫荧光分析.获取各组胫骨标本,进行生物力学测试,然后进行免疫组化染色,制成切片.所有切片用辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G联合培养并标记,用免疫荧光显微镜随机观察6个视野.通过流式细胞计数和DCFH-DA法对细胞内氧化应激反应进行评估,并用CellQuest Pro软件进行分析.将成骨细胞在成骨媒介中培养12小时,并确认其分化情况.
结果：
第一部分：(1)随着BMI值的增加,骨质疏松患病率有降低的趋势(2)脊柱骨折占总体骨折的34.64%(1541处),股骨近端骨折占总体骨折的31.21%(1388处),尺桡骨远端骨折占21.58%(960处),肱骨近端骨折占2.57%(559处),女性患者均多于男性.(3)女性患者随着初潮年龄的增加,骨质疏松患病几率呈下降趋势,但差异无明显统计学意义(χ2=1.175,P>0.05).(4)吸烟可能对女性骨质疏松性骨折的发生有促进作用.(5)骨质疏松症患者合并内科疾患以高血压最多,糖尿病和风湿免疫性疾病次之.(6)经过骨质疏松骨折的综合治疗,半年后血清P1NP、S-CTX均较术前下降,25(OH)D3轻度上升,但无统计学意义.(7)术后VAS评分及SF-36评分较术后明显改善(P>0.05).
第二部分：(1)Tan-ⅡA能增强成骨细胞的活性,且其存在剂量依赖性,与ASN组和PBS组相比有统计学差异(p<0.05).Tan-ⅡA用药后增加过氧化氢浓度继续培养24小时,依然能观察到成骨细胞的活性增强.从形态学观察发现Tan-ⅡA对破骨细胞的分化具有抑制作用.(2)Tan-ⅡA通过RANKL通路抑制成骨细胞的凋亡,促进破骨细胞的凋亡.在体外实验中Tan-ⅡA组抗凋亡基因Bcl-2和p53的表达水平在成骨细胞中升高,而在破骨细胞中下降(p<0.05).(3)生物力学测试后显示,在刚度、极限强度和弹性模量三个方面TAN-ⅡA组骨组织的力学性能具有明显优势(p<0.05).(4)Tan-ⅡA组脯氨酸/酰胺-Ⅰ,磷酸盐/酰胺-Ⅰ,磷酸盐/脯氨酸的比值最高(p<0.05)表明Tan-ⅡA对骨组织的矿化和细胞外基质的形成具有积极作用.(5)在成骨细胞中Tan-ⅡA组ALP的mRNA表达上调,过氧化氢与氧自由基的的蓄积水平下降,超氧化物歧化酶和硫代巴比妥酸反应物表达水平上调,氧自由基水平明显低于其他两组(p<0.05).可见TAN-ⅡA能抑制成骨细胞因氧化应激作用而产生的不良影响.(6)Tan-ⅡA作用于NF-κB的靶基因(TNF-α,iNOS和COX2)使其表达水平下调,TRAF-1和IAP表达水平上调(p<0.05);P56,ⅠκB和ⅠκB激酶在Tan-ⅡA组同时下调(p<0.05).
结论：
(1)天津地区骨质疏松性骨折患者有以下特征：随着BMI值的增加,骨质疏松患病率有降低的趋势;吸烟可能对女性骨质疏松性骨折的发生有促进作用;骨质疏松症患者合并内科疾患以高血压最多,糖尿病和风湿免疫性疾病次之.(2)脆性骨折中,脊柱骨折最多,其次依次是股骨近端骨折,尺桡骨远端骨折和肱骨近端骨折,女性患者均多于男性.(3)月经初潮年龄对女性患者的骨质疏松患病率影响尚不明确.(4)规范的骨质疏松骨折综合治疗能提高患者的生活质量.(5)利用骨质疏松大鼠为模型,从动物实验到体外细胞培养两个方面观察了Tan-ⅡA对骨细胞的影响及其作用机制.同时对骨细胞活性和破骨细胞分化进行检测来验证Tan-ⅡA对骨质疏松的治疗作用,亦对其介导的信号通路进行分析.试验结果提示Tan-ⅡA对骨质疏松大鼠成骨细胞的氧化应激有抵抗作用,此效果是通过NF-κB信号通路来实现的.