论文部分内容阅读
目的：①观察Wnt经典信号通路中β-catenin在大鼠膝关节骨性关节炎(OA)滑膜组织的表达，以及补肾活血方对胞核β-catenin和下游基因MMP-7的调控作用。②观察Wnt/β-catenin通路j生大鼠膝关节骨性关节炎滑膜细胞中的表达情况，及补肾活血方中药血清对胞核β-catenin和MMP-7的调控作用。 方法： 体内实验：1.通过Hulth方法建立Wistar大鼠膝关节骨关节炎模型；2.将造模成功后的大鼠分为OA模型组、补肾活血方组、西乐葆组，与正常大鼠组对照；3.大鼠连续给药4周，每日一次，每次5ml/只；4.摘取大鼠膝关节滑膜组织；5.通过蛋白印记法研究补肾活血方对大鼠膝关节骨性关节炎模型滑膜组织中β-catenin和下游基因MMP-7的影响。 体外实验：1.通过Hulth方法建立Wistar大鼠膝关节骨性关节炎模型；2.用胶原酶消化法原代培养正常滑膜细胞和OA滑膜细胞；3.蛋白印记法观察正常滑膜细胞和OA滑膜细胞胞核中β-catenin的表达差异；4.将OA滑膜细胞分为模型组、补肾活血方组和西乐葆组，与正常滑膜细胞组对照，采用MTT法观察补肾活血方与西乐葆对滑膜细胞的生长抑制作用；蛋白印记法检测滑膜细胞胞核β-catenin和细胞MMP-7的表达；酶联免疫吸附法检测滑膜细胞上清液中MMP-7的表达。 结果： 体内试验：1.wistar大鼠膝关节骨关节炎造模成功；2.WesternBlot结果显示OA滑膜组织核蛋白β-catenin、总蛋白中MMP-7表达均高于正常滑膜组织，补肾活血方组与西乐葆组中OA滑膜组织核蛋白β-catenin、总蛋白中MMP-7表达有明显下调作用。 体外实验： 1.Wistar大鼠膝关节骨性关节炎造模成功，并且成功培养出大鼠膝关节骨性关节炎滑膜细胞，并用免疫荧光法鉴定，滑膜细胞胞浆中vimentin蛋白呈阳性表达； 2.补肾活血方药物血清作用于大鼠膝关节骨性关节炎滑膜细胞48h的抑制率为10.56％，西乐葆药物血清作用于大鼠膝关节骨关节炎滑膜细胞的抑制率为10.34％，最接近于有效抑制率(10％)，因此选取10％的补肾活血方药物血清与10％的西乐葆药物血清作用于OA滑膜细胞48h来作为后续实验干预滑膜细胞生长的最佳浓度与时间： 3.WesternBlot结果显示OA滑膜细胞中胞核β-catenin、细胞MMP-7蛋白含量分别为3.33±0.06、3.16±0.06，均高于正常滑膜细胞0.90±0.02、0.92±0.05。模型组与正常组相比有统计学意义(P<0.05)；补肾活血方作用于OA滑膜细胞中胞核β-catenin、细胞MMP-7蛋白含量分别为0.87±0.04、0.87±0.04，相比OA滑膜细胞3.33±0.06、3.16±0.06，胞核β-catenin、MMP-7表达有明显下调作用，二者相比有统计学意义(P<0.05)； ELASA结果显示OA滑膜细胞上清液中MMP-7蛋白含量为76.86±0.57，明显高于正常滑膜细胞上清液11.6±0.51，二者相比有统计学意义(P<0.05)；补肾活血方作用于OA滑膜细胞上清液中MMP-7蛋白含量为41.7±0.69，可以下调OA滑膜细胞上清液中MMP-7蛋白含量，二者相比具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 1.β-catenin在OA滑膜组织胞核中表达升高，提示大鼠膝OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路可能是激活的。 2.β-catenin在OA滑膜细胞胞核中表达升高，证实wnt/β-catenin信号通路在大鼠膝OA滑膜中是激活的。 3.MMP-7在OA滑膜细胞中表达升高，证实了MMP-7在OA滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路中呈阳性表达。 4.OA滑膜细胞上清液中MMP-7表达的升高，可以从实验层面证明OA滑膜细胞可以将其异常分泌的MMP-7分泌到关节腔内，从而发挥对软骨的降解作用。 5.OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路的活化、MMP-7的表达升高可能是导致关节软骨降解，促进骨性关节炎形成的机制之一。 6.补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用是其抑制软骨降解，促进软骨修复，治疗骨性关节炎的可能机制之一。