二氧化氯对家蚕微粒子虫Nosema bombycis孢子作用机理研究

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二氧化氯具有高效广谱的杀菌能力,作用持久、快速,用量少,受pH值的影响小,强烈的氧化作用及不与有机物产生氯化作用等特点,被认为是一种可能对人类健康事业产生巨大影响的灭菌消毒剂。因此进行二氧化氯对微生物,特别是对家蚕微粒子虫(Nosemabombycis,N.b)孢子的作用机理研究,为解决日益严峻的野外昆虫微粒子病与家蚕的交叉感染对蚕种生产的威胁有重要的现实意义,对稳定性二氧化氯在蚕业生产和其他领域的开发利用有重要的理论指导意义。 本论文对N.b孢子的分离纯化条件进行研究。确定二氧化氯的中和剂及其浓度。用传统的生物试验验证了二氧化氯杀灭微粒子虫的作用效果,并确定了其最低有效作用浓度。建立了鉴别微粒子虫死活的新方法。通过光学显微镜、扫描电镜和透射电镜等技术对二氧化氯杀灭N.b孢子作用机理做了病理组织学研究。用紫外可见光分光光度计、原子分光光度计和试剂盒等对二氧化氯作用N.b孢子后引起的各种物质的泄漏和破坏做了初步探讨。从生物学效应、细胞生物学、细胞的分子生物学等不同层次对二氧化氯对N.b孢子的作用机理进行较深入的研究。主要获得的研究结果如下: 1.差速离心和自然沉降交替结合的方法对收集的N.b孢子进行分离,利用普通低温高速离心机,对N.b孢子进行连续蔗糖梯度离心法和不连续蔗糖梯度离心法纯化,结果获得大量精制纯化的孢子,为一般条件的实验室对N.b孢子的分离纯化提供了经验。对二氧化氯作用反应的中和剂及其浓度进行了研究,结果认为,在本试验二氧化氯浓度范围内,其合适的中和剂是0.5%的Na2S203溶液。 2.用传统的生物试验对二氧化氯杀灭N.b孢子的作用效果进行研究,结果表明二氧化氯制剂对家蚕微粒子虫的灭活作用非常敏感,在低至15mg/L的浓度作用30min或者25mg/L作用5min都可以完全杀死孢子,为利用该药防治微粒子病,并把该药正式开发为专门针对野外昆虫与家蚕交叉感染的桑叶消毒剂提供了可靠的依据。 3.对N.b孢子的染色检验方法进行多种尝试并在国内首次利用AO-PI复合荧光染料染色,在荧光显微镜下鉴别杀灭后的N.b孢子。结果表明经过该染料染色后可以很快鉴别死活孢子和处于死亡时期的孢子,操作简便、灵敏、实用有效,对消毒剂杀灭N.b孢子效果的鉴定方法具有很好的应用价值。 4.利用电子显微镜对二氧化氯作用后的N.b孢子进行观察,结果表明,扫描电镜下观察,发现25mg/L浓度二氧化氯处理的N.b孢子多数变得膨润,孢子表面和背景上出现白色颗粒状物质,随着作用浓度增加,白色颗粒状物质增多,孢子开始出现褶皱和萎缩。经催芽处理后于扫描电镜下观察到,20mg/L及其以上浓度二氧化氯处理的N.b孢子失去发芽能力,在Omg/L-15mg/L浓度之间,二氧化氯作用浓度与发芽孢子数量呈明显的负相关。透射电镜下观察发现,二氧化氯处理的N.b孢子细胞壁和原生质膜膨松、界限变宽,内部细胞器变形、溶解出现空腔,极丝内部芯状结构被破坏,细胞核变形甚至消失,随着作用浓度(5mg/L~50mg/L)的增大和作用时间的延长,上述现象变得明显。较高浓度二氧化氯处理的孢子胞质固缩。 5.利用紫外可见光分光光度计和原子吸收分光光度计对二氧化氯处理后N.b孢子的紫外吸收物质、原子和糖泄漏情况进行研究,结果表明物质泄漏特别是蛋白质、K+和糖的泄漏及Ca2+浓度异常在杀灭N.b孢子中起着重要作用。此外还发现二氧化氯对N.b孢子的上述作用都是在很短时间发生的。 6.通过测试盒测定二氧化氯作用后N.b孢子中的脂质和ATP酶的变化情况,结果发现二氧化氯可以迅速氧化N.b孢子中的脂质,降低、破坏ATP酶活性。 综合上述研究结果说明二氧化氯首先氧化N.b孢子细胞壁中的脂质和蛋白,破坏微生物的酶系统,使膜通透性增加,K+、蛋白质等物质大量外泄而使细胞代谢功能受到抑制及破坏,最终引起细胞死亡。
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