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催乳素对鹅的繁殖活动具有重要影响,它是通过其特异性受体一催乳素受体发挥生物学作用的。因此在对马岗鹅的繁殖活动的遗传和生理调控机制的研究过程中,进行了鹅催乳素及其受体基因的克隆,并对它们的核苷酸序列及编码的氨基酸残基序列进行了结构和功能分析,研究结果如下:
1.根据鸡和鸭的催乳素基因同源性设计引物,利用RT-PCR方法和RACE方法,获得了鹅催乳素cDNA全长序列和基因组DNA,递交GenBank收录,登录号分别为DQ345782和DQ345783。鹅催乳素基因cDNA全长1294bp,基因组DNA全长6467bp,其中5-UTR长305bp,3-UTR长310bp;编码区长690bp,含5个外显子,长度分别为28bp、182bp、108bp、180bp、192bp;4个内含子,长度分别为:1495bp、396bp、1388bp和1883bp,内含子的长度与鸭和鸡相应内含子相近。
2.序列分析表明,在cDNA水平上,鹅催乳素与鸭、鸡、火鸡和鹌鹑催乳素的同源性分别为98.4%、92.0%、92.2%和91.9%;由鹅催乳素cDNA推导的多肽由229个氨基酸残基组成,其中1—30位氨基酸残基为信号肽,其后为199个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽与鸭、鸡、火鸡和鹌鹑的同源性分别为98.5%、93.5%、92.5%和94.5%。
3.同源性分析结果显示在第4、¨、58、174、19l和199位的6个半胱氨酸残基非常保守,在禽类、哺乳动物和鱼类的保守区域(PDl一PD4)有30多个氨基酸残基完全相同;由进化树关系中的氨基酸变化可以看出,鹅催乳素与其他哺乳动物和鱼类的同源关系相对较低。与鸡、火鸡和鹌鹑不同而与鸭一样,鹅PRL在第6位氨基酸残基存在一个潜在N一链糖基化位点(Asn-Gly-Ser),Westernblot分析垂体蛋白发现存在有24kD和22kD两种PRL,两者数量之比为1.08:1。
4.在催乳素5-UTR,TATA盒位于转录起始位点上游24bp处,还存在1个潜在Pit.1结合位点(TGAATATGAA);5’-UTR的.74/-40区域发现一个血管活性肠肽反应元件(VIPresponseelement,VRE),其核心序列为(.64/-53,TGCTGAATGTAT);5个潜在八核苷酸模体结合性蛋白转录因子1(Octamerfactor-1,OCT-1)结合位点;一个潜在NF-kappaB结合位点(TGAAATTCCC)。在3-UTR,终止子下游188bp处存在polyA信号序列AATAAA,并且在此信号序列15bp后至少有13个碱基的polyA。
5.对催乳素成熟肽二级结构分析表明催乳素是一个全α一螺旋结构蛋白,约50%的氨基酸残基为α-螺旋,其余部分则折叠成无规卷曲;三级结构分析表明催乳素蛋白折叠成4个长α-螺旋束,并形成上.上一下.下的结构。
6.根据鸡和火鸡的催乳素受体基因同源性设计引物,利用RT-PCR方法和RACE方法,获得了鹅催乳素受体cDNA全长序列,递交GenBank收录,登录号为DQ209271。鹅催乳素受体基因cDNA全长3014bp,其中5’.UTR长306bp,3-UTR长212bp,编码区2496bp。
7.序列分析表明,在cDNA水平上,鹅催乳素受体与鸡、火鸡和鸽子催乳素的同源性分别为88.3%、87.9%、87.4%;由鹅催乳素受体cDNA推导的多肽由831个氨基酸残基组成,1-24位氨基酸残基为信号肽序列,其后为807个氨基酸残基组成的成熟肽。在蛋白水平上,鹅催乳素受体与鸡、火鸡、鸽子的同源性分别为86.7%、83.8%、84.4%。
8.在催乳素受体5-UTR,TATA盒位于翻译起始位点上游154bp处,含有1个潜在的上游活化因子(upstreamstimulatingfactor,USF)结合位点(TATCAAGTGATCTG),1个潜在的激动蛋白4(activatorprotein-4,AP-4)结合位点(GCTGCTGATT),1个潜在的类固醇调控元件结合结合蛋白1(sterolregul~oryelement-bindingprotein1,SREBP—1)结合位点(TCAAGTGATCT),1个潜在的Evi.1结合位点(GATATGATATT),2个潜在的c-Ets—l(p54)蛋白结合位点,1个潜在的Spl(stimulatingprotein1)结合位点(GGGGCGGGGA)。在3-UTR,终止子下游176bp处发现polyA信号序列AATAAA,并且在此信号序列2Ibp后有至少10个bp的polyA序列。
9.对催乳素受体成熟肽二级结构分析表明PRLR有53.41%多的氨基酸残基为无规卷曲,α-螺旋、p一折叠分别为20.32%、26.27%。膜外域三级结构分析表明每个结构域(Dl和D2)含有7个p折叠股,这7个β折叠股以三明治形式折叠成2个反向平行的β折叠片,其中一个由3个p折叠股组成,另一个由4个β折叠股组成。
10.比较了鹅与多种家禽、哺乳动物和鱼类的PRLR、PLR和GHR氨基酸序列的同源性,发现保守氨基酸残基多在膜外域近膜端和胞内域近膜端,共43个氨基酸残基在各物种中呈现高度保守性。其中的四个半胱氨酸(Cys255、Cys265、Cys308和Cys319)在各物种中都存在;跨膜域的氨基酸保守性很低;胞内域的Boxl中有5个氨基酸残基(Pr0513、Pr0516、Pr0518、Lys519、Ileu520)高度保守。