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本研究采用在大鼠L4-L5、L5-L6椎间孔内插入小钢棒的方法制作背根神经节慢性压迫(CCD)大鼠疼痛模型，该模型的特点与临床腰椎间盘突出引起的腰背痛和坐骨神经痛相似，并通过疼痛行为学及HE染色等方法观察推拿对CCD模型的影响。在证明推拿可以对CCD模型大鼠产生明显镇痛效应的基础上，借助蛋白质组学技术观察推拿对CCD模型大鼠DRG蛋白表达的影响，筛选相关差异蛋白，并选择其中的机械敏感性离子通道蛋白进行进一步验证，探讨推拿镇痛机制，从思路和方法上丰富推拿镇痛研究。 研究分为三章，第一章通过观察推拿对CCD模型大鼠疼痛行为学和DRG形态学的影响，证明推拿的镇痛效应;第二章采用蛋白质组学技术研究推拿对CCD模型大鼠DRG神经元蛋白质表达的影响，分析推拿前后DRG神经元的差异蛋白及其相关功能、通路等信息;第三章选择差异蛋白中的机械敏感性离子通道Piezo2蛋白为研究靶点，通过免疫组化检测、蛋白免疫印迹法等方法，进一步验证推拿对Piezo2蛋白的影响。 第一章 推拿对CCD模型大鼠疼痛行为学和DRG形态学的影响 目的:建立CCD大鼠模型，探讨推拿对大鼠疼痛行为学和DRG形态学的影响。 方法:将大鼠分成4组，分别为空白组、假手术组、CCD模型组和CCD模型+推拿组，每组各8只。将大鼠在测试环境中连续适应1周后，连续两天测其右后足的机械足反射阈值(PWT)、热缩足反射潜伏期(PWL)，取平均值作为造模前的基础数值，然后在其L4-L5、L5-L6右侧椎间孔进行CCD造模，造模后分别在第1天、3天、5天、7天、10天、14天、17天、21天对4组大鼠右后足的PWT、PWL进行测试;CCD模型+推拿组于造模后第4天起使用无线触觉力按摩指套对大鼠右侧环跳、承扶、殷门穴施按揉手法，按揉力度10N、频率为2Hz、持续5min，2次/天，连续干预18天。造模后第22天，处死大鼠后取L5-L6段的右侧DRG进行HE染色。 结果:(1)CCD模型大鼠造模侧PWT值变化:假手术组与空白组大鼠的PWT值无显著性差异;CCD模型组大鼠在造模后第1天起右后足的PWT值出现明显下降，第1天至第7天下降趋势较为明显，第7天、21天一直维持在较低水平，与假手术组相比较具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)，说明采用CCD造模即小钢棒压迫DRG的方法可以造成大鼠造模侧下肢机械痛觉过敏;CCD模型+推拿组大鼠在造模后第1天右后足PWT值明显下降，至第7天下降至最低水平，之后开始出现缓慢上升，造模后第17天至第21天，与CCD模型组相比较具有显著性差异(P＜0.01)，说明推拿手法干预能够降低CCD造模所引发的机械痛觉过敏。 (2)CCD模型大鼠造模侧PWL值变化:假手术组与空白组大鼠的PWL值无显著性差异;CCD组大鼠在造模后第1天其右后足的PWL值出现明显下降，第1天至第5天下降趋势较为明显，第7天至21天一直维持在较低水平，与假手术组相比较具有显著性差异(p＜0.01)，说明采用小钢棒压迫DRG的方法可以造成大鼠造模侧下肢热痛觉过敏;CCD模型+推拿组大鼠在造模后第1天右后足PWL值明显下降，至第5天下降至最低水平，之后开始出现缓慢上升，造模后第10天至第21天，与CCD模型组相比较具有显著性差异(P＜0.01)，说明推拿手法干预能够降低CCD造模所引发的热痛觉过敏。 (3)CCD模型大鼠造模侧DRG形态学变化:CCD模型组DRG组织在40倍光镜下DRG细胞肿胀溶解、破裂，细胞周围有大量炎性细胞浸润，说明小钢棒的长时间卡压造成压迫部位DRG细胞结构异常;CCD模型+推拿组DRG组织在40倍光镜下与CCD组无显著性差异，表明推拿手法干预对DRG细胞结构异常无显著改变。 结论:推拿对CCD模型大鼠小钢棒卡压引发的疼痛行为学具有改善作用，但推拿手法干预对CCD造模引起的DRG细胞损伤无显著改善。 第二章 基于蛋白质组学技术分析推拿对CCD模型大鼠DRG神经元蛋白质表达的影响 目的:本实验拟采用蛋白质组学(iTRAQ)技术探讨推拿对CCD模型大鼠DRG神经元蛋白质表达的影响，筛选相关差异表达蛋白。 方法:动物分组、造模方法、干预方法同前一章。造模后第22天处死大鼠，取右侧L4-L5、L5-L6节段的DRG组织，进行SDS-PAGE电泳、FASP酶解、iTRAQ标记、SCX分级和串联质谱分析，对质谱Raw文件处理，通过Proteome Discoverer和Mascot软件进行鉴定分析，利用Gene Ontology、KEGG等数据库进行生物信息学分析。 结果: (1)CCD模型组与假手术组之间的差异蛋白共499个，其中上调237个，下调262个;通过GO注释富集分析发现这些差异蛋白主要参与多细胞生物过程、单多细胞有机体过程、单组织代谢过程、解剖构造的发育、多细胞生物发育、系统发育等317个生物过程，参与发挥离子结合、阳离子结合、金属离子结合、过渡金属离子结合、细胞骨架蛋白结合、氧化还原活性等70种分子功能，分布于包括细胞骨架、胞外区、肌动蛋白细胞骨架、收缩纤维、肌原纤维、肌节、黏着连接、Z盘、肌球蛋白复合物等在内的32种细胞组分。KEGG通路富集分析发现差异蛋白参与了催产素信号通路、醚脂代谢、缺氧诱导因子1信号通路、Jak-STAT信号通路、B细胞受体信号通路、胰岛素信号通路、甘油磷锚合成、白细胞跨内皮迁移等20条信号通路。 (2)CCD模型+推拿组与CCD模型组的差异蛋白共431个，其中上调162个，下调269个;其中包含机械敏感性离子通道蛋白1种，即Piezo2蛋白(F1M208)，呈上调表达。通过GO注释富集分析发现这些差异蛋白主要参与单组织过程、生物调节、生物过程的调节、刺激反应、多细胞生物过程、单多细胞有机体过程、发育过程、解剖构造的发育、生物过程的正调控等33个生物过程，参与发挥转运活性、DNA结合、蛋白激酶结合、DNA特异性序列结合、氧化还原酶活性、抗体结合、NADP结合、生长因子受体结合、硫酯酶结合、纤维原细胞生长因子受体结合等33种分子功能，分布于膜、胞内非膜性细胞器、非膜性细胞器、膜部、细胞质膜、细胞骨架、固有膜、微管细胞骨架等29种细胞组分;参与HIF-1信号通路、病毒性心肌炎、紧密连接、朊病毒病、黏着连接、轴突导向、致病性大肠杆菌感染、醚脂代谢、类风湿性关节炎等22种通路。 (3)CCD模型/假手术组比较组与CCD模型+推拿/CCD模型比较组共有164个共同差异蛋白，且在两个比较组中的表达变化呈反向关系，通过对比CCD模型/假手术组比较组与CCD模型+推拿/CCD模型比较组通路富集分析结果，发现两个比较组有两条共同的信号通路，分别是HIF-1信号通路和催产素信号通路。 结论:利用蛋白质组学(iTRAQ)技术研究大鼠DRG神经元蛋白表达情况，发现CCD模型造模前后、推拿干预前后均出现一系列表达有差异的蛋白，其中发现一种机械敏感性离子通道蛋白—Piezo2蛋白;通过组间比较与生物信息学分析，探讨了这些差异蛋白参与的生物过程、分子功能和信号通路情况。通过差异蛋白筛选和分析，为进一步深入开展推拿镇痛机制研究打下初步基础。 第三章 推拿对CCD模型大鼠DRG神经元机械敏感性离子通道Piezo2蛋白影响的研究 目的:以机械敏感性离子通道Piezo2蛋白为研究靶点，通过免疫组化检测、蛋白免疫印迹法等方法，研究推拿对CCD模型大鼠DRG神经元Piezo2蛋白的影响。 方法:动物分组、造模方法、干预方法同前一章。造模后第22天处死大鼠，取右侧L4-L5、L5-L6节段的DRG组织，进行免疫组化检测和Western Blot检测。 结果: (1)免疫组化检测结果:被IB4标记的细胞不同时表达Piezo2，表明Piezo2在小直径神经元无显著表达;被PEP标记的细胞同时表达Piezo2，表明Piezo2在中直径神经元显著表达;被NF200标记的细胞同时表达Piezo2，表明Piezo2在大中直径神经元显著表达。 (2)Western Blot检测结果:CCD模型+推拿组Piezo2含量明显高于其余三组(P＜0.05)，可以初步说明推拿手法能够显著地提升CCD模型背根神经节Piezo2的含量。 结论:机械敏感性离子通道Piezo2蛋白可以在大鼠DRG的大中直径神经元和中直径神经元显著性表达;推拿手法能够显著地提升CCD模型背根神经节神经元Piezo2蛋白的含量。