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目的：本研究为防治肝癌的常用有效治法——健脾益气法提供确凿的依据；对健脾益气治法显著下调的DEN诱发大鼠肝癌17个基因表达片段(ESTs)进行完整cDNA表达序列筛选，并对其序列进行生物学特征分析：选择16个在DEN诱发大鼠肝癌中高表达相对应人同源性最高的人类基因在肝癌细胞中进行功能的初步检测，以期发现与肝癌密切相关新的功能基因。希望这样的研究能有助于了解健脾益气治法在基因表达调控方面的作用，为健脾益气治法防治肝癌提供有效的分子作用靶点，为中医药临床防治肝癌提供理论及实验依据，以及进一步丰富肝癌发生与发展规律等。
方法：(1)从健脾益气法防治肝癌的理论依据、临床及实验研究进行文献综述；(2)在导师原有课题研究的基础上，充分利用基因芯片的数据资料、国际计算机网络生物信息资源及现代先进的分子生物学技术从项目组业已建立的大鼠正常肝组织和二乙基亚硝胺(DEN)诱发肝癌组织cDNA文库或提取新鲜肝组织总。RNA，逆转录获得cDNA，采用：RACE-PCR、电子克隆结合RT-PCR验证方法克隆健脾益气治法显著下调17个ESTs片段的cDNA完整表达序列；并利用NCBI提供的公共数据库资源分析其编码氨基酸的生物学特征；(3)将健脾益气治法明显下调的16个大鼠基因cDNA序列的编码区(CDS)与人的基因组序列(或nr数据库)进行BLAST比对，以相对应人同源性最高的人类基因进行干扰siRNA序列设计；以体内转录的方法构建Psilencer2.1-U6-siRNA的表达载体，应用电转染技术转染人肝癌SMMC-7721细胞中，以转染阴性siRNA真核表达载体(siRNA靶序列与人所有基因都不同源)的SMMC-7721细胞为对照排除非特异性抑制作用；通过RT-RCR检测目的基因mRNA水平的表达；倒置相差荧光显微镜观察转染情况，观察目的基因表达沉默后肝癌细胞形态的变化；MTT法检测转染后细胞增殖受抑制情况，籍此以检测目的基因在人类肝癌发生、发展中的作用，探讨其与中医证候、治法的关系。
结果：(1)健脾益气法防治肝癌有确凿的理论依据；临床应用情况表明健脾益气法为目前中医治疗肝癌的基本大法；实验研究情况表明健脾益气法具有多项抗癌效应； (2)筛选出17个健脾益气治法明显下调ESTs片段的含完整编码区全长或近全长cDNA表达序列，并发现其中编号为Z1、Z3、Z8、z10、Z11、Z12、Z14、Z16、Z17等9个基因为新基因，成功实现GenBank登录。将其命名为：健脾益气药物下调大鼠肝癌ZH1、ZH3、ZH8、ZH10、ZH11、ZH12、ZH14、ZH16、ZH17基因。基因登录号(acccession number identifier)分别为：AM258958、AB259152、AM258959、AM258960、AB259153、AB259154、AM258961、AM258962、AM258963；(3)将健脾益气治法明显下调的16个大鼠基因cDNA序列的编码区(CDS)与人的基因组序列(或nr数据库)进行BLAST比对，以相对应人同源性最高的基因进行干扰siRNA序列设计，采用RNA干扰技术检测这16个人类基因在人肝癌细胞中的作用，发现LMO4、TCEA3、Eif3s10、CyclinD1等基因在人肝癌细胞表达沉默后，肝癌细胞形态学发生改变，出现凋亡现象，细胞增殖减缓。
结论：脾虚是肝癌的重要病机，脾虚贯穿肝癌发生发展的始终，脾虚证是肝癌发生发展中的常见证型，健脾益气法是防治肝癌的常用有效治法，具有多项抗癌效应。在成功运用Affymetrix Rat 230A生物芯片大通量的检测不同中医治法对大鼠肝癌基因转录水平上的差异，发现一批不同中医治法能明显调整的基因基础上，充分利用生物信息学资源，成功克隆出9个中医健脾益气治法明显调控的新基因的cDNA表达序列，为今后国内外进一步深入研究这些新基因奠定了基础。采用RNA干扰技术，首次发现LMO4、TCEA3、Eif3s1.0等3个基因在人肝癌细胞表达沉默后，肝癌细胞形态学发生改变，出现凋亡现象，细胞增殖减缓，提示这些基因在人肝癌细胞的增殖方面具有重要的生物学作用。这些基因可能是健脾益气法直接或间接调控的靶点；可能是肝癌组织中与脾虚证候相关的基因；并可以用作中医药治疗筛选的靶基因。该发现，对于研究健脾益气治法的部分作用机制，进一步丰富肝癌发生与发展规律具有重要的科学意义，并为今后的深入研究奠定了基础。