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Ghrelin作为生长激素促分泌素受体(GHSR)的天然配体,主要由胃分泌,是一种具有促进生长激素释放、调节食欲和能量稳态、调节免疫机能等多种生物学作用的脑肠肽。为研究鸡Ghrelin对鸡细胞免疫功能的调节作用,本论文开展了以下三个试验。
试验一淋巴细胞分离培养方法的优化。试验采集21日龄岭南黄鸡的外周血,肝素钠抗凝后4℃保存于多支15mL一次性离心管中,每管10mL外周血。取几支加入6%葡聚糖,每支加1mL,沉聚红细胞30min,用RPMI-1640分别对所有血样进行不同比例稀释,利用淋巴细胞分离液进行梯度离心,显微镜下检查细胞纯度与活率。采用MTT比色法测定不同丝裂原及不同浓度对淋巴细胞增殖的影响,测定不同细胞密度对OD492敏感度的影响。结果表明:加6%葡聚糖沉聚红细胞的外周血,4倍稀释,3000rpm离心20分钟,分离到的淋巴细胞纯度最高,活率大于90%;ConA浓度为333ng/mL、LPS浓度为5μg/mL时,淋巴细胞增殖效果最佳(P<0.05);当细胞浓度低于5×106cells/mL时,OD492值差异不显著,当细胞浓度大于5×106cells/mL,则有显著差异(P<0.05)。
试验二Ghrelin对鸡脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子分泌及mRNA表达的影响。试验采用MTT比色法、RIA法和实时荧光定量RT-PCR法研究了不同浓度Ghrelin对离体培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)分泌和IL-2、IL-6与Ghrelin受体(GHSR)mRNA表达的影响。结果表明,一定剂量Ghrelin促进淋巴细胞的增殖,对IL-6的分泌有较好的促进作用,而对IL-2的分泌作用不明显,甚至在LPS刺激下随着浓度增大有抑制趋势;10nM Ghrelin处理使IL-2、IL-6的mRNA转录水平显著提高(P<0.05),其他浓度与对照组无显著差异,而对GHSRmRNA的表达随着Ghrelin浓度升高而降低。
试验三Ghrelin对鸡外周血淋巴细胞增殖、细胞因子分泌及mRNA表达的影响。分别采用MTT比色法、RIA法和实时荧光定量RT-PCR法研究不同浓度Ghrelin对离体培养的鸡外周血淋巴细胞增殖、IL-2和IL-6的分泌及IL-2、IL-6与GHSR mRNA表达的影响。结果表明,所有Ghrelin处理组显著促进无其它丝裂原刺激的外周血淋巴细胞增殖(P<0.05),1nM Ghrelin处理组显著促进T淋巴细胞增殖(P<0.05),而Ghrelin对B淋巴细胞的增殖无显著促进作用;0.1nM Ghrelin处理对T淋巴细胞IL-2的分泌和mRNA表达都具有显著的促进作用(P<0.05),而在LPS刺激下,随着Ghrelin处理浓度的增大,反而抑制IL-2的分泌,但0.1nM Ghrelin处理显著提高IL-2 mRNA的表达(P<0.05)。Ghrelin处理对IL-6分泌有一定的促进作用,但对IL-6 mRNA表达的作用不明显。Ghrelin处理对ConA刺激下的外周血淋巴细胞的GHSR mRNA转录水平无显著影响,但显著抑制LPS刺激下GHSR mRNA的表达。
上述结果提示,Ghrelin具有调节岭南黄鸡细胞免疫功能的作用。