论文部分内容阅读
在禽类，催乳素对卵泡发育、卵泡类固醇激素的分泌和就巢的调节机理方面都有重要的作用。研究表明，高水平的PRL抑制垂体促性腺激素的分泌还能直接抑制卵泡的发育使雌禽停止产蛋进入就巢。然而实际生产中观察到，催乳素并不仅仅具有抑制繁殖活动的作用，中等浓度的PRL水平还具有促进卵泡发育的作用。其作用机理尚不清楚，为了进一步研究PRL的作用，本试验制备并纯化了鸡PRL，并检验了它的活性。
试验目的：构建鸡催乳素融合基因的原核表达质粒PR-PRL，并将PR-PRL在大肠杆菌中表达；探索高效表达的条件并进行大规模培养表达体系，并对获得的重组蛋白进行纯化复性；注射鸽子分析重组融合蛋白的生物学活性，细胞培养分析该融合蛋白对于卵泡发育的影响机制。
试验方法：根据鸡的催乳素基因设计引物，利用PCR方法制备PRL基因，插入PRSETA融合蛋白表达载体中，构建重组质粒PR-PRL。经转化宿主菌DH5a,筛选高效率转化子，摇瓶培养，用IPTG诱导高效表达蛋白质。表达产物经50％Ni-NTA树脂利用亲和层析在变性条件下纯化后，经尿素和pH梯度透析逐步除去尿素对蛋白进行复性。将获得的蛋白注射鸽子检测其生物学活性。无血清培养鸡的卵泡颗粒细胞，并用重组PRL蛋白处理细胞，分析催乳素对于卵泡增殖及分泌的影响。
试验结果：成功构建了PR-PRL原核表达质粒；SDS-PAGE分析显示PR-PRL在菌体中表达，0.1mM IPTG诱导4小时后蛋白的表达量达高峰；鸽子试验表明此蛋白具有生物学活性，其活性是天然PRL，活性的17％-25％；无血清培养鸡的卵泡颗粒细胞，在添加不同浓度PRL情况下，各组间的细胞增殖无差异。说明PRL对颗粒细胞的分裂增殖没有影响，其对卵泡发育可能的作用机制是通过影响LH受体表达调控来实现的。