论文部分内容阅读
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry毒素是世界上应用最为广泛的杀虫蛋白之一。Cry毒素蛋白的制备多依赖宿主细菌原核表达或转基因植物表达等方法。本研究利用修饰后的M13噬菌粒成功展示出Cry1Ac毒素蛋白，构建了M13噬菌体高效展示Cry1Ac毒素技术平台。免疫印迹分析（Western blot analysis）结果显示M13噬菌体展示的Cry1Ac毒素片段能够被Cry1A多克隆抗体识别。体外水解实验显示，M13噬菌体展示的Cry1Ac毒素片段经小菜蛾（Plutella xylostella）中肠酶液处理后能够保持稳定的～70kDa的蛋白片段。生物活性测定及半定量分析结果显示，效价为2×1011pfu/mL的M13噬菌体展示的Cry1Ac毒素能够达到等同于Bt HD-73菌株表达的野生型Cry1Ac毒素对小菜蛾3龄幼虫的杀虫活性（LC50=0.12μg/mL）。本研究成功利用M13噬菌体高效展示Cry1Ac毒素蛋白，并保持其对鳞翅目靶标害虫的毒性作用。尔后，本研究对Cry1Ac毒素DomainⅡ上loopα8、loop2、loop3三个环区进行随机突变，成功构建了Cry1Ac受体结合域随机突变噬菌体文库，为后续筛选新型Cry毒素的研究奠定基础。
茶小绿叶蝉是重要的茶叶害虫，茶小绿叶蝉的为害会引起茶叶的一系列生理变化。在半翅目刺吸式取食方式中，茶小绿叶蝉的取食方式属于典型的破裂细胞取食。此类取食方式的半翅目昆虫在用其口针刺吸茶树的嫩芽时会分泌唾液蛋白酶用于消化从茶树叶肉细胞和茎薄壁细胞摄取的蛋白质。在Bt Cry毒素作用机制中，原毒素蛋白被靶标昆虫消化系统中蛋白酶活化是其产生毒性作用的关键步骤。为了鉴定在茶小绿叶蝉消化系统中的蛋白酶，进一步分析Cry1Ac毒素在小绿叶蝉消化系统中的酶稳定性，本研究通过转录组及蛋白质组测序，从茶小绿叶蝉若虫的唾液腺和消化道中共鉴定出129个潜在蛋白酶基因，包括了七类潜在的蛋白酶。消化蛋白酶的转录丰度分析和酶活性分析表明，组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和丝氨酸蛋白酶（包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）在消化道中有极高的表达丰度，而在唾液腺中相对较低。此外，通过与褐飞虱（Nilaparvata lugens）、灰飞虱（Laodelphax striatellus）、黑尾叶蝉（Laodelphax striatellus）和豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）等半翅目昆虫的对比发现，茶小绿叶蝉唾液腺和肠道中的消化蛋白酶主要成分与上述半翅目昆虫存在明显差异。同源进化树分析结果显示，半翅目昆虫体内的氨肽酶N及其类似物与丝氨酸蛋白酶分别能够被分为两个聚类，其中一个聚类在中肠中高表达，而另一个聚类在唾液腺中表达量相对更高。体外水解试验证明M13噬菌体展示的ssDsbA-Cry1Ac-PⅢ蛋白在茶小绿叶蝉中肠酶液处理后能够形成与小菜蛾幼虫肠酶液处理后类似的60kDa稳定蛋白片段，证明小绿叶蝉体内的蛋白酶组成及表达丰度虽然与鳞翅目害虫有所差异，但不对噬菌体展示的Cry1Ac毒素产生进一步水解。因此，Cry1Ac随机突变噬菌体文库能够用于体内筛选对小绿叶蝉高效的新型Cry毒素的研究。
本研究成功利用M13噬菌体展示出具有完整杀虫活性功能的Cry1Ac毒素蛋白，并构建了Cry1Ac受体识别域随机突变噬菌体展示文库。通过转录组和蛋白质组数据分析从茶小绿叶蝉唾液腺和消化道内发现了大量与Cry毒素作用机制中蛋白活化相关的蛋白酶，并证明M13噬菌体展示的Cry1Ac毒素蛋白在小绿叶蝉肠酶液作用下能够保持其毒素蛋白结构的稳定性。由于Cry1Ac毒素蛋白对半翅目刺吸式口器昆虫毒性作用较差，本研究为高效筛选对茶小绿叶蝉具有毒性作用的新型Cry毒素提供依据。
茶小绿叶蝉是重要的茶叶害虫，茶小绿叶蝉的为害会引起茶叶的一系列生理变化。在半翅目刺吸式取食方式中，茶小绿叶蝉的取食方式属于典型的破裂细胞取食。此类取食方式的半翅目昆虫在用其口针刺吸茶树的嫩芽时会分泌唾液蛋白酶用于消化从茶树叶肉细胞和茎薄壁细胞摄取的蛋白质。在Bt Cry毒素作用机制中，原毒素蛋白被靶标昆虫消化系统中蛋白酶活化是其产生毒性作用的关键步骤。为了鉴定在茶小绿叶蝉消化系统中的蛋白酶，进一步分析Cry1Ac毒素在小绿叶蝉消化系统中的酶稳定性，本研究通过转录组及蛋白质组测序，从茶小绿叶蝉若虫的唾液腺和消化道中共鉴定出129个潜在蛋白酶基因，包括了七类潜在的蛋白酶。消化蛋白酶的转录丰度分析和酶活性分析表明，组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和丝氨酸蛋白酶（包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）在消化道中有极高的表达丰度，而在唾液腺中相对较低。此外，通过与褐飞虱（Nilaparvata lugens）、灰飞虱（Laodelphax striatellus）、黑尾叶蝉（Laodelphax striatellus）和豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）等半翅目昆虫的对比发现，茶小绿叶蝉唾液腺和肠道中的消化蛋白酶主要成分与上述半翅目昆虫存在明显差异。同源进化树分析结果显示，半翅目昆虫体内的氨肽酶N及其类似物与丝氨酸蛋白酶分别能够被分为两个聚类，其中一个聚类在中肠中高表达，而另一个聚类在唾液腺中表达量相对更高。体外水解试验证明M13噬菌体展示的ssDsbA-Cry1Ac-PⅢ蛋白在茶小绿叶蝉中肠酶液处理后能够形成与小菜蛾幼虫肠酶液处理后类似的60kDa稳定蛋白片段，证明小绿叶蝉体内的蛋白酶组成及表达丰度虽然与鳞翅目害虫有所差异，但不对噬菌体展示的Cry1Ac毒素产生进一步水解。因此，Cry1Ac随机突变噬菌体文库能够用于体内筛选对小绿叶蝉高效的新型Cry毒素的研究。
本研究成功利用M13噬菌体展示出具有完整杀虫活性功能的Cry1Ac毒素蛋白，并构建了Cry1Ac受体识别域随机突变噬菌体展示文库。通过转录组和蛋白质组数据分析从茶小绿叶蝉唾液腺和消化道内发现了大量与Cry毒素作用机制中蛋白活化相关的蛋白酶，并证明M13噬菌体展示的Cry1Ac毒素蛋白在小绿叶蝉肠酶液作用下能够保持其毒素蛋白结构的稳定性。由于Cry1Ac毒素蛋白对半翅目刺吸式口器昆虫毒性作用较差，本研究为高效筛选对茶小绿叶蝉具有毒性作用的新型Cry毒素提供依据。