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土壤盐渍化是影响世界农业生产的重要因素之.如何开发利用盐渍土已成为农业生产和环境生态学亟待解决的问题.红麻是一种高价值的工业纤维经济作物,具有较大的商业价值,同时,因其具有的耐盐性以及巨大的生物学产量等特性,可以作为盐渍化土壤的修复植物.目前,有不少关于红麻耐盐性的研究,但相关研究主要集中于耐盐栽培、生理响应等,有关红麻耐盐分子机理方面的研究却鲜有报道.
因此,本研究主要以红麻P3A(耐盐品系)和P3B(盐敏感品系)为材料,研究了在盐胁迫下种子活力、农艺性状和生理生化以及细胞学结构变化;同时利用转录组和蛋白组学手段比较分析两者在基因转录和蛋白表达水平的差异.筛选和鉴定关键基因、靶蛋白和关键代谢调控途径,以期能够全面解析红麻的耐盐机理,为更好地利用红麻修复土壤盐污染奠定理论基础.本研究主要的实验结果如下:
1.种子活力、农艺性状和生理生化指标测定和细胞学观察结果表明,红麻P3A为耐盐性显著强于P3B.在盐胁迫下,品种P3A和P3B的种子发芽势、发芽率、发芽指数和相对盐害率73%、73%、33%和15.14%,44%、48%、18%和70%.P3B的相对盐害率几乎是P3A的5倍,说明P3A在种子萌发阶段更能适应高盐胁迫.苗期形态指标测定结果表明,P3B中的SPAD值、根鲜重、根径、茎宽、株高、根长和根体积分别均比P3A显著下降比P3A.盐胁迫4d后,P3B幼苗的黄叶较P3A多;除细胞内CO2浓度(Ci)略有增加外,P3A的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)均显著高于P3B,叶绿素含量(chl a、chl b)也显著高于P3B.另外,盐胁迫后P3B的MDA含量增加幅度大于P3A,而P3A的SOD活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均高于P3B,表明在盐胁迫条件下P3A受到的损伤较小,而清除活性氧能力较强,表现出相对强的耐盐能力.此外,细胞学研究表明,在盐胁迫下,品种P3A的叶绿体和类囊体发生了膨胀和空泡化,而P3B的叶绿体和类囊体则发生了降解.结果表明红麻对盐胁迫的响应是从种子萌发开始的,通过提高气体交换指标,提高叶绿素含量,维持紧密的叶绿体和类囊体结构以保持光合能力.此外,线粒体的稳定性确保了更多的能量生产,以解决红麻的盐胁迫状况.
2.转录组学测序结果共鉴定到115045个transcripts和45724个unigenes,序列比对结果表明,42.56%、27.78%、32.28%、48.88%和62.34%的unigenes能与Pfam、string、KEGG、Swissprot和NR数据库显著匹配(E<1e-5),而57.08%、36.06%、46.65%、61.18%和71.68%的transcripts能与上述数据库匹配.至少73.49%的unigenes和85.17%的transcripts在四个数据库中有一个显著的匹配;在所有数据库中,共注释了4242个unigenes和17129个transcripts.
3.盐胁迫与对照组间差异表达基因(DEGs)(FDR≤0.05,log2FC≥1)分析结果表明,在P3A中38.06%表现上调和61.93%下调;在P3B中49.13%表现上调,50.87%下调.同时鉴定了48个转录因子家族.进一步分析表明,在盐胁迫下,转录因子WRKY、AP2/EREBP、MYB、GRAS和Hsfs家族的基因,以及LEA、PsbA、PK、GSTs、NPR1和TGA等基因,在P3A的表达水平高于P3B.另外,GO富集和KEGG途径分析表明,这些DEGs参与离子稳态和转运、渗透调节、水分亏缺反应、抗氧化剂、ROS清除、细胞膜保护、光系统Ⅱ(PSⅡ)光损伤修复周期、类囊体部分和植物激素信号转导途径,可能与红麻的耐盐性有关.
4.比较iTRAQ定量蛋白质组学分析结果表明,P3A中分别有89(74.78%)个上调和30(25.2%)下调差异蛋白(DAPs),在P3B中有133(69.27%)个上调和59(30.7%)下调差异蛋白(FC>1.5或<0.67;p<0.05).生物信息学分析推断在P3A中有160个DAPs显著富集到GO分类中,其中至少71个DAPs可以映射到47条KEGG通路;而在P3B中,146个DAPs显著富集到GO分类中,其中至少99个DAPs可以映射到61条KEGG通路.其中,12条KEGG途径在两个品种中均显著富集(p<0.05).包括卟啉和叶绿素代谢,谷胱甘肽代谢,甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢,花生四烯酸代谢以及乙醛酸和二羧酸酯代谢途径.
5.盐反应中起重要作用的DAPs包括ATP、α-D-葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶、醛脱氢酶(ALDH)、ATP依赖的Clp蛋白酶(clpB)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、ATP合酶和光系统II亚单位(PsBS).值得注意的是,P3A中的差异累积蛋白质少于P3B,然而,P3A中这些DAP的功能特性和调节代谢途径之间的分布表明,它们有助于修复光系统Ⅱ(PSⅡ),维持以ATP形式存在的能量流,线粒体氧化磷酸化参与糖代谢和淀粉合成、清除活性氧和醛类、维持细胞内稳态和离子平衡、氨基酸从头合成、转录后和翻译后变化,在红麻盐胁迫应答中起关键作用,将有助于阐明红麻耐盐的分子机制.
因此,本研究主要以红麻P3A(耐盐品系)和P3B(盐敏感品系)为材料,研究了在盐胁迫下种子活力、农艺性状和生理生化以及细胞学结构变化;同时利用转录组和蛋白组学手段比较分析两者在基因转录和蛋白表达水平的差异.筛选和鉴定关键基因、靶蛋白和关键代谢调控途径,以期能够全面解析红麻的耐盐机理,为更好地利用红麻修复土壤盐污染奠定理论基础.本研究主要的实验结果如下:
1.种子活力、农艺性状和生理生化指标测定和细胞学观察结果表明,红麻P3A为耐盐性显著强于P3B.在盐胁迫下,品种P3A和P3B的种子发芽势、发芽率、发芽指数和相对盐害率73%、73%、33%和15.14%,44%、48%、18%和70%.P3B的相对盐害率几乎是P3A的5倍,说明P3A在种子萌发阶段更能适应高盐胁迫.苗期形态指标测定结果表明,P3B中的SPAD值、根鲜重、根径、茎宽、株高、根长和根体积分别均比P3A显著下降比P3A.盐胁迫4d后,P3B幼苗的黄叶较P3A多;除细胞内CO2浓度(Ci)略有增加外,P3A的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)均显著高于P3B,叶绿素含量(chl a、chl b)也显著高于P3B.另外,盐胁迫后P3B的MDA含量增加幅度大于P3A,而P3A的SOD活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均高于P3B,表明在盐胁迫条件下P3A受到的损伤较小,而清除活性氧能力较强,表现出相对强的耐盐能力.此外,细胞学研究表明,在盐胁迫下,品种P3A的叶绿体和类囊体发生了膨胀和空泡化,而P3B的叶绿体和类囊体则发生了降解.结果表明红麻对盐胁迫的响应是从种子萌发开始的,通过提高气体交换指标,提高叶绿素含量,维持紧密的叶绿体和类囊体结构以保持光合能力.此外,线粒体的稳定性确保了更多的能量生产,以解决红麻的盐胁迫状况.
2.转录组学测序结果共鉴定到115045个transcripts和45724个unigenes,序列比对结果表明,42.56%、27.78%、32.28%、48.88%和62.34%的unigenes能与Pfam、string、KEGG、Swissprot和NR数据库显著匹配(E<1e-5),而57.08%、36.06%、46.65%、61.18%和71.68%的transcripts能与上述数据库匹配.至少73.49%的unigenes和85.17%的transcripts在四个数据库中有一个显著的匹配;在所有数据库中,共注释了4242个unigenes和17129个transcripts.
3.盐胁迫与对照组间差异表达基因(DEGs)(FDR≤0.05,log2FC≥1)分析结果表明,在P3A中38.06%表现上调和61.93%下调;在P3B中49.13%表现上调,50.87%下调.同时鉴定了48个转录因子家族.进一步分析表明,在盐胁迫下,转录因子WRKY、AP2/EREBP、MYB、GRAS和Hsfs家族的基因,以及LEA、PsbA、PK、GSTs、NPR1和TGA等基因,在P3A的表达水平高于P3B.另外,GO富集和KEGG途径分析表明,这些DEGs参与离子稳态和转运、渗透调节、水分亏缺反应、抗氧化剂、ROS清除、细胞膜保护、光系统Ⅱ(PSⅡ)光损伤修复周期、类囊体部分和植物激素信号转导途径,可能与红麻的耐盐性有关.
4.比较iTRAQ定量蛋白质组学分析结果表明,P3A中分别有89(74.78%)个上调和30(25.2%)下调差异蛋白(DAPs),在P3B中有133(69.27%)个上调和59(30.7%)下调差异蛋白(FC>1.5或<0.67;p<0.05).生物信息学分析推断在P3A中有160个DAPs显著富集到GO分类中,其中至少71个DAPs可以映射到47条KEGG通路;而在P3B中,146个DAPs显著富集到GO分类中,其中至少99个DAPs可以映射到61条KEGG通路.其中,12条KEGG途径在两个品种中均显著富集(p<0.05).包括卟啉和叶绿素代谢,谷胱甘肽代谢,甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢,花生四烯酸代谢以及乙醛酸和二羧酸酯代谢途径.
5.盐反应中起重要作用的DAPs包括ATP、α-D-葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶、醛脱氢酶(ALDH)、ATP依赖的Clp蛋白酶(clpB)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、ATP合酶和光系统II亚单位(PsBS).值得注意的是,P3A中的差异累积蛋白质少于P3B,然而,P3A中这些DAP的功能特性和调节代谢途径之间的分布表明,它们有助于修复光系统Ⅱ(PSⅡ),维持以ATP形式存在的能量流,线粒体氧化磷酸化参与糖代谢和淀粉合成、清除活性氧和醛类、维持细胞内稳态和离子平衡、氨基酸从头合成、转录后和翻译后变化,在红麻盐胁迫应答中起关键作用,将有助于阐明红麻耐盐的分子机制.