论文部分内容阅读
水稻黄矮病毒是一种植物弹状病毒,属于单链的负链RNA病毒.它的基因组从3端依次为leader,编码蛋白的基因N,P,3,M,G,6,L和5′端trailer.N基因编码核衣壳蛋白,P基因编码磷酸化蛋白,M基因编码基质蛋白,G基因编码糖蛋白,L基因编码RNA聚合酶.基因6编码的蛋白功能尚未知道.基因3位于P基因和M基因之间.在其它植物弹状病毒(Lettucenecrotic yellow virus,Northern cereal mosaic virus,Sonchus yellow net virus)的相同位置也具有开放读码框,这样的基因在动物弹状病毒中却未发现.植物病毒在侵染寄主时面临着动物病毒所没有的障碍即植物细胞壁对病毒扩散的限制,植物病毒在长期的进化中发展出了运动蛋白来实现病毒对植物入侵后的胞间运动和系统感染.由此在上述的几种植物弹状病毒中存在而在动物弹状病毒中没有的基因其编码的蛋白可能和植物病毒的系统侵然有关.目前发现的植物病毒的运动蛋白至少分为五类:一,30K超级家族蛋白;二,三基因连锁编码的蛋白;三,芜箐花叶病毒组运动蛋白;四,HSP-like蛋白;五,一系列小于10kDa的蛋白.在30K超家族的植物病毒中存在两种病毒胞间运动机制.第一种胞间运动机制和TMV运动机制相似,运动蛋白介导病毒胞间运动不需要衣壳蛋白的参与;第二种胞间运动机制依赖于管状结构,运动蛋白介导病毒胞间运动需要衣壳蛋白的参与.水稻黄矮病毒P3蛋白由294个氨基酸组成,分子量约32kDa.通过反式互补运动缺陷PVX的实验证实了P3是运动蛋白.二级结构预测发现P3蛋白中央区包含6个β-折叠和4个α-螺旋片段,组成了三个30K超家族所具有的核心结构.P3蛋白中央区的两侧有一个短的C端和一个较长的N端.其N端二级结构与CaMV的N端二级结构很相近.在序列比对中发现P3的Ile-Gln-Asp(162-164)和Gly(232)构成了在一些30K超家族成员中发现的LXDX71G基序.这些结果说明P3蛋白是属于30K超家族的运动蛋白.进一步研究表明P3蛋白具有同单链RNA的结合活性而且这种结合没有序列特异性.同时,P3蛋白还具有与RYSV N蛋白特异性蛋白结合活性.通过缺失突变分析,P3蛋白与N蛋白的结合需要第61-90位氨基酸的参与.在GFP-3融合蛋白转基因植物中发现GFP-3融合蛋白定位在细胞核中.反向遗传学是指已知基因序列进而研究基因功能的策略.弹状病毒是负链RNA病毒其生活周期中并无DNA阶段,因此对它们基因的功能研究有想当难度.利用反向遗传学系统通过加入DNA环节可以实现在DNA水平对弹状病毒基因组的分子操作,为研究弹状病毒提供了方便.动物弹状病毒狂犬病病毒已利用反向遗传学技术从cDNA克隆得到了有侵染性的病毒,而在植物弹状病毒中尚无反向遗传学系统的报道.为了便于研究水稻黄矮病毒基因的功能,我们构建了由表达RYSV的N蛋白、P蛋白和L蛋白的表达质粒和含有报道基因的minigenome组成的反向遗传学系统.正在可以用它来研究leader和trailer的功能和基因3的功能等,从而了解RYSV的生活周期中各个基因的功能和地位.