PPM--18和Vitamin C联合用药诱导膀胱癌细胞系死亡机制的研究

• 作 者: 付珊珊
• 机 构: 华中科技大学
• 出 处: 华中科技大学
• 发表日期: 2020年期
• 关键词: 膀胱癌

膀胱癌是人类泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。近年来，膀胱癌的发病率和死亡率呈现上升趋势，严重威胁人类生存与健康。传统治疗膀胱癌的方法，例如膀胱切除术、化学疗法、放射疗法和免疫疗法等虽有显著地治疗效果，但高复发、远迁移以及毒副作用，仍然极大影响病人生存率和生活质量。因此，探索新型抗击膀胱癌方案显得愈发重要。PPM-18(NQN1)是一种新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，结构上看具有萘醌环，在体外具有杀伤白血病细胞的作用。VitaminC是一种天然的水溶性维生素，在体外和体内具有广泛的抗癌效果，但具有使用剂量大的缺点。本论文通过研究低剂量PPM-18和低剂量VitaminC联合用药体外处理膀胱癌细胞系，探寻新型膀胱癌治疗方案。
　　通过MTS实验表明，5μM的PPM-18和5mM的VitaminC联合用药能够显著地降低膀胱癌T24和EJ细胞活力。通过明场拍照、结晶紫、细胞克隆等比较直观的实验，也发现联合用药有效地抑制膀胱癌细胞增殖，并诱发膀胱癌细胞死亡。同时，在其他六种常见的癌细胞系中也出现了同样的作用效果。通过流式细胞术实验显示，PPM-18联合VitaminC能够显著地诱导膀胱癌T24和EJ细胞凋亡。通过WesternBlot实验，却没有检测到凋亡指示蛋白Caspase-3、PARP蛋白的切割。有趣的是，WesternBlot却检测到了联合用药处理后自噬指标蛋白LC3BII的上调。另外，通过透射电子显微镜观察细胞亚显微结构，发现联合用药处理的EJ细胞内出现了自噬体的积累，这些结果表明PPM-18和VitaminC的联合用药能够有效地诱导膀胱癌细胞发生自噬。通过流式细胞术，检测到了联合用药处理后膀胱癌细胞线粒体膜电势的下降，此外通过透射电子显微镜也观察到了线粒体的破坏。为了进一步探索联合用药诱导细胞死亡的机制，我们采用流式细胞术，检测细胞内活性氧(ROS)水平，结果显示联合用药诱导了膀胱癌细胞内ROS水平的显著上升。ROS清除剂NAC和联合用药共处理，使得膀胱癌细胞活力得到了显著地回升，之后通过明场拍照、结晶紫、细胞克隆等实验也验证了上述结果。通过WesternBlot检测，NAC下调了联合用药诱导的高水平的LC3BII。流式细胞术检测，NAC和联合用药共处理拯救了联合用药诱导的线粒体膜电势的下降，这些结果表明，PPM-18和VitaminC联合用药是通过激活细胞内ROS水平，来有效杀死膀胱癌细胞的。通过人正常细胞L02对联合用药进行安全性评估，发现联合用药没有引起明显的L02细胞活力下降，而且流式细胞术也未检测到L02细胞凋亡，说明PPM-18和VitaminC联合用药对正常细胞是安全的。
　　综上所述，本研究发现，PPM-18和VitaminC联合用药通过激活细胞内ROS，诱导线粒体膜电势下降，最终导致细胞产生非caspase-3依赖的凋亡性细胞死亡，并伴随着自噬的产生，但对正常细胞没有影响。因此，这种联合用药方案具备成为新型抗膀胱癌疗法的潜力。