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HBV可导致慢性乙型肝炎，肝硬化乃至肝细胞癌，严重威胁人类的健康。目前，全世界共有约3.5亿人患有慢性HBV感染，其中中国约占1/3。预防和控制HBV的传播是医学研究的重要课题。从当前的研究水平和治疗条件来说，不可能彻底清除隐藏在肝细胞核内的cccDNA。但是高水平HBV复制导致的高滴度的病毒载量通过刺激病人的免疫系统继而造成肝脏损伤，转氨酶升高，将使病情严重化恶性化，因此抗病毒治疗就显得尤为重要。目前最好的抗病毒药物的疗效也仅能达到50％左右。国内外医学界所公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：α干扰素和核苷类似物。干扰素治疗有一定的毒副作用，所以核苷类似物药物的应用越来越普遍。慢性乙肝病人接受同一核苷类似物长期治疗后，由于HBV的反转录酶缺乏3-5的校正功能，导致其容易产生耐药性突变而使治疗失败，病毒复制反弹，病情恶化等。迄今为止，人们对这些经过药物筛选出现的耐药株及其耐药机理等已经进行了大量的研究。当前已经被美国食品药物组织批准的用于治疗慢性乙肝的核苷类似物主要有五种。鉴于短期内将不再可能出现更多的核苷类似物药物，因此，为了指导临床病毒监测和治疗，对现有的几种核苷类似物的用药剂量、耐药表型、交叉耐药机理，以及如何制定更有效的联合用药措施进行深入研究显得尤为必要。本研究主要内容包括：
第一章前言部分，首先概述了HBV的基本知识，包括其发现、流行现状、传播途径以及对健康的危害，病毒学分类特点、血清型的概念、病毒粒子和基因组的结构特征，以及病毒的生活周期等。其次重点介绍了HBV基因组的突变，核苷类似物的耐药突变，以及相关动物模型的研究进展。
第二章，主要是根据计算机预测出HBV反转录酶可能与TDF相互作用的位点，继而用融合PCR方法构建出一系列相应的突变体，并且在体外肝癌细胞系中对这些突变体的复制能力，以及对常用核苷类似物的敏感性等进行了深入研究。首先检测了所构建的所有突变体在体外的复制能力，病毒相关抗原的表达水平。研究了野生型病毒对五种核苷类似物药物的EC50，继而重点检测了所有可复制的突变体病毒对泰诺福韦的敏感性，从而筛选出两个对泰诺福韦(Tenofovir,TDF)敏感性降低的突变体rtP177G和rtF249A。然后通过realtime-PCR方法对代表TDF的耐药株复制水平的有效复制形式HBV rcDNA进行了定量分析，计算出了它们对TDF的EC50值和耐药倍数。进一步检测了这两个突变体和野生型相比对其他四种药物的敏感性没有显著性差异。结果表明，rtP177G和rtF249A对TDF耐药倍数分别为3.7和21.5，而对其他四种核苷类似物敏感性和野生型相比无显著性差异。
第三章，分别将含有WT/rtA194T/rtM204V/rtP177G/rtF249A的HBV1.3倍基因组片段连接到pAAV载体上，构建得到HBV复制性载体pAAV-WT、pAAV-rtP177G和pAAV-rtF249A。然后通过高压尾静脉注射的方法导入小鼠肝脏，在小鼠体内模拟HBV慢性感染。收集不同时间点的小鼠血清以及肝脏样本，检测血清中HBsAg、HBeAg的表达以及HBV的拷贝数；免疫组织化学染色方法检测肝脏样本中的HBcAg表达水平；并用Southern blot检测小鼠肝脏中的HBV DNA水平。注射后3天就能检测到HBsAg的表达，高水平维持到7天左右然后逐渐降低，且HBsAg的表达不受TDF的抑制。在血清中不能检测到HBeAg的表达。TDF治疗明显的抑制了HBcAg的表达，血清中的HBV DNA拷贝数，肝脏中HBV的复制。结果表明，我们成功构建了HBV的抗病毒感染动物模型。
通过对病毒多聚酶的三维结构进行分析，对于研发新型有效的抗病毒药物，研究潜在的耐药位点等具有重要的意义。本论文首次将这种方法应用到HBV的耐药研究中。TDF具有很强的抗HIV和HBV的疗效，耐药基因屏障较高。是继上述四种核苷类似物之后非常有潜力的治疗HBV的药物。相比于其他四种核苷类似物LAM、ADV、TFV和ETV，TDF的上市时间相对较短，相关的耐药突变株极为罕见。迄今，仅rtA194T被报道报导为TDF的可疑耐药位点。因此，本文主要关注了TDF的耐药性突变。通过对多聚酶与TDF作用的三维结构进行分析，预测出一些可能的耐药位点，然后分别从细胞水平和小鼠水平进行验证，得到的结果再作为对模型进行修改优化的依据，不仅对于指导TDF的临床治疗具有重要意义，同时也为病毒的耐药性突变研究奠定了新的基础。