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DNA是生命的基本物质，人类如何游刃有余的操纵DNA，对人的健康、环境等具有重要意义。近年来，一种基于CRISPR-Cas9蛋白的DNA操作技术在基因组编辑和基因表达调控等领域显示出了其革命性的威力。2015年，来源于CRISPR系统2类Ⅴ型的Cas12a（旧称Cpf1）蛋白被鉴定，该蛋白同样可以进行基因组编辑但其特性又不同于Cas9。Cas12a特性还没有充分了解，对其探索有助于进一步了解Cas12a的切割机理并有利于新工具的开发。本论文的主要内容分为两个方面，分别是Cas12a切割特性、机理研究和CRISPR工具箱的拓展。 (1)Cas12a切割特性和机理研究。首先，我们精确鉴定了Cas12a在靶标双链DNA上的切割位点。研究发现，Cas12a切割非靶标链的第14位和第18位附近，而不是之前报导的只切割在18位;其次，本文发现缩短的crRNA能够大大降低非靶标链第18位的切割活性，而依旧保留其切割第14位的活性。接着，研究发现Cas12a对靶标单链DNA的切割是不依赖于PAM序列的程序化切割方式，称之为cis切割;而一旦三元复合体（Cas12a/crRNA/target DNA）形成后，其便会显示出trans切割的活性，并切割体系中非靶标的任意单链DNA，但同时会保护复合体内的靶标单链DNA。通过针对Cas12a的单氨基酸突变实验，以及基于已报导的Cas12a和Ⅴ-B型C2c1的结构比较结果，提出了Cas12a对双链DNA的靶标链、非靶标链切割和单链DNA的cis、trans链切割都是由Cas12a中的一个RuvC催化口袋催化完成的。 (2)对CRISPR工具箱的拓展，即标准化拼接方法C-Brick，DNA加密方法CADS与特异性核酸检测方法HOLMES。首先，根据Cas12a具有RNA引导切割双链DNA并形成粘性末端的特点，设计并开发了一套称为C-Brick的拼接标准。由于C-Brick具有长识别序列与短疤痕拼接序列的优点，该标准的开发有助于克服目前基于Ⅱ类限制性内切酶的拼接过程中所遇到的诸多问题。第二，根据Cas12a针对非靶标单链DNA的trans切割特性，开发了一套称为CADS的DNA加密方法，增加了基于DNA存储和交流信息的安全性。该方法利用Cas12a/crRNA/靶标单链DNA形成三元复合体的trans切割活力，来切除反应体系中的假引物，从而只保留真引物;然后利用PCR反应来获取正确的扩增条带以帮助解读DNA信息。第三，同样基于Cas12a的trans切割特性，并结合PCR扩增技术，开发了特异性检测核酸分子的方法，称为HOLMES。该原理是当体系中存在靶标DNA时，形成的Cas12a三元复合体会切割探针单链DNA序列（两端分别含有荧光基团和淬灭基团），从而两基团分开后发出荧光。该方法不仅可以快速检测DNA或RNA病毒，并区分它们的相似株，也可以快速鉴定人SNP基因型。 另外，本论文也对人工合成的crRDNA（即含有核糖核酸和脱氧核糖核酸的嵌合体crRNA）的应用进行了初步探索，旨在用人工合成的引导RDNA直接进行基因组编辑等工作。虽然crRDNA在体外反应中体现了较好的切割活性，但其体内的编辑效率还需进一步提高。 综上所述，本论文首先研究了Cas12a对双链和单链DNA的切割特性及其机理:1）精确地鉴定了Cas12a切割双链DNA的位点，2）鉴定了对单链DNA的cis切割特性，3）鉴定了对单链DNA的trans切割特性，4）提出了Cas12a切割DNA的机理。接着根据Cas12a的切割特点，拓展了CRISPR工具箱:1）开发了C-Brick标准化拼接方法，2）CADS加密方法，3）特异性核酸检测方法（HOLMES）。另外，本文还对crRDNA的应用进行了初步探索。本论文在特性方面的研究加深了对Cas12a特性与机理的理解，而方法的建立对于各自领域有巨大的应用潜力，也是同类方法的重要补充。