论文部分内容阅读
根结线虫是世界农业生产上的主要病害，其寄主的广泛、不易防治，已严重制约着世界农业的可持续发展。由于根结线虫寄生特性、难以人工培养、不能获取突变株，所以根结线虫基因功能的研究进展比较缓慢。直到2008年，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）全基因组测序的完成，其基因的相关研究也引起越来越多的关注，加速了基因功能研究的进程。随着RNA干扰机理的阐明和应用技术的逐步成熟，这为研究植物寄生线虫-南方根结线虫的基因功能，提供了良好的技术支持和基因信息平台。本研究借助于秀丽隐杆线虫滞育基因的相关信息和RNA干扰数据库（RNA interference database，RNAiDB），利用生物信息学技术，从南方根结线虫蛋白预测数据库中搜索出了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）滞育蛋白的同系物，并采用RNAi技术初步鉴定了同源基因在南方根结线虫中的功能，为大规模确定植物寄生线虫滞育基因奠定了基础。主要研究结果如下: 1.建立了高效培养和收集南方根结线虫的体系。利用温室条件，改善番茄培养基质，利于线虫的侵染和卵块的产生，为后续实验提供了大量线虫材料;采用细胞过滤网替代常用的贝尔曼漏斗分离法，可让大量线虫通过从而将杂质分离，减少线虫的损失，并且收集的线虫活力较高。 2.利用生物信息学高效快速筛选出了靶基因WBMinc07480和WBMinc13296。采用M.incognita预测蛋白组数据库和凭借C.elegans幼虫滞育基因的信息，本研究通过Blastx序列同源比对法，从南方根结线虫预测蛋白库中，筛选出了与DAF-9和DAF-12相似性较高的序列，分别为WBMinc07480和WBMinc13296及WBMinc13295。蛋白结构域预测结果显示，WBMinc07480含有DAF-9的Cytochrome P450结构域(pfam00067)，WBMinc13296和WBMinc13295分别具有DAF-12 DBD和DAF-12 LBD。本研究选取了与C.elegans滞育基因具有相似性的WBMinc07480和WBMinc13296作为靶基因进行后续RNAi功能研究验证。 3.提出了南方根结线虫J2幼虫同源于秀丽隐杆线虫滞育dauer幼虫的假说，并从南方根结线虫的J2幼虫和雌虫中均克隆出了基因WBMinc13296、WBMinc13295和WBMinc07480基因的保守区域。 4.利用RNAi技术初步验证了WBMinc07480和WBMinc13296基因功能。为明确靶基因的功能，本研究采用两段浸泡法刺激J2幼虫体外吞食dsRNA或siRNA。J2幼虫经WBMinc07480_ dsRNA和WBMinc13296_ dsRNA处理后，侵染率分别下降了29.48％和73.18％，后者处理显著抑制或者延缓了线虫的发育。体外取食了WBMinc13296的4个靶位点siRNAs的J2幼虫，与对照相比，不仅侵染率下降了21.38-71.08％，而且体外半存活时间也减少了18.67-35.56％，RT-PCR结果显示，与4个靶位点同源的WBMinc13296 mRNA相对表达量降低了3.63-16.68倍。