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目的：
通过分析肝癌患者和健康对照血清miRNA表达谱，寻找差异表达的miRNAs并通过qRT-PCR技术予以验证，探讨经验证差异表达的miRNAs在肝癌诊断中的临床应用价值。
方法：
1.选取69例均经临床和病理确诊且尚未接受手术、化疗、放疗等任何临床治疗肝癌患者作为研究对象，详细收集患者的临床及实验室检查资料，同时选取慢性活动性乙肝患者47例、健康体检者40例作为对照。确定研究对象后，采集研究对象静脉血3ml，分离血清保存待用。
2.在实验对象中选取3例肝癌患者血清和3例正常对照者血清，构建小RNA测序文库，基于illumina测序技术平台，进行单端测序，获得有差异表达的miRNAs，对差异表达miRNAs进行靶基因预测和候选靶基因的确定。
3.选取部分显著性差表达的miRNAs作为研究指标，采用qRT-PCR技术检测肝癌血清、慢性活动性乙肝血清和正常对照血清中miRNAs表达水平。根据qRT-PCR检测结果，初步确定肝癌患者血清差异表达miRNAs并作其与肝癌的logistic逐步回归分析，最后确定有效的差异表达miRNAs。分析最终入选的miRNAs与肝癌患者临床特征及实验室检测指标的相关性。
4.应用ROC曲线分析miRNAs对肝癌的诊断价值，包括灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值、阴性预测值等，评价肝癌传统标志物AFP单独及与miRNAs联合检测在肝癌的诊断中的价值。
5.统计学处理：采用SPSS16.0统计软件，实验数据以（-x±s）表示，采用单因素方差分析肝癌组、慢性活动性肝炎组和正常对照组之间miRNA的差异表达，P＜0.05有统计学意义。用logistic回归逐步分析有差异表达的miRNA(选入标准α=0.05，剔除标准α=0.10)，筛选出有诊断价值的miRNA，求出Logistic回归方程。用Spearman相关分析miRNA与各临床特征指标的关系，P＜0.05为差异具有统计学意义。使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析单个指标和多指标联合检测对肝癌的诊断价值。
结果：
1.在肝癌血清和正常对照血清中筛选出42个差异性表达miRNAs，其中35个miRNAs表达上调，7个miRNAs表达下调。部分差异表达miRNAs可能与基因转录、细胞代谢、细胞周期以及细胞凋亡等相关基因的调空有关。
2.肝癌组和慢性活动性乙肝组血清中miR-320c、miR-4429、miR-4532较正常对照组血清相对表达量有上升趋势，且差异具有显著性差异（P＜0.05）；miR-1290在三组血清中的相对表达量无显著性差异；肝癌组血清中miR-769-5p、miR-223-3P较慢性活动性乙肝组和正常对照组血清相对表达量有下降趋势，且差异具有显著性差异（P＜0.05）；慢性活动性乙肝组血清中miR-744-5p的相对表达量与肝癌组和正常对照组血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05），肝癌组血清中miR-744-5P的相对表达量与正常对照血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05）；慢性活动性乙肝组血清中miR-150-5p的相对表达量与肝癌组和正常对照血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05）。
3.根据以上统计结果，将miR-320c、miR-769-5p、miR-223-3p、miR-744-5p、miR-4429共5个差异表达miRNA入选为logistic回归分析，最后将miR-769-5p和miR-4429共2个差异表达miRNA入选，并做回归方程：P=1/[1+e-(0.687-4.919X1+2.151X2)](方程中的X1、X2分别代表miR-769-5p和miR-4429的相对表达量)。miR-769-5p和miR-4429与肝癌患者临床病理在指标均无显著性相关（P＞0.05）。
4.miR-769-5p、miR-4429和AFP单项检测和联合检测在诊断肝癌中的ROC曲线分析：在单项检测中，miR-769-5p的AUC(曲线下面积)为0.803（95CI：0.691～0.914，P＜0.001），灵敏度最高；AFP的AUC为0.798（95CI：0.707～0.889，P＜0.001）；miR-4429的AUC为0.877（95CI：0.811～0.943，P＜0.001），特异性最好；在联合检测中，miR-769-5p联合miR-4429的AUC为0.874（95CI：0.806～0.942，P＜0.001）；miR-769-5p联合AFP的AUC为0.929（95CI：0.880～0.977，P＜0.001）；miR-4429联合AFP的AUC为0.934（95CI：0.888～0.981，P＜0.001）；三者联合检测的的AUC为0.956（95CI：0.917～0.995，P＜0.001），灵敏度和准确度均最高
结论：
通过二代测序技术发现肝癌血清中存在众多差异表达miRNAs，经qRT-PCR检测及logistic回归分析，筛选出miR-769-5p和miR-4429为肝癌的有效诊断指标，ROC分析显示其具有较好的灵敏度和特异性，具备成为肝癌生物标志物的潜能。传统肿瘤标志物AFP的灵敏度和特异性较低，联合与miR-769-5p、miR-4429可以提高肝癌诊断的敏感度、特异性，对肝癌的发现、诊断有重要价值。
通过分析肝癌患者和健康对照血清miRNA表达谱，寻找差异表达的miRNAs并通过qRT-PCR技术予以验证，探讨经验证差异表达的miRNAs在肝癌诊断中的临床应用价值。
方法：
1.选取69例均经临床和病理确诊且尚未接受手术、化疗、放疗等任何临床治疗肝癌患者作为研究对象，详细收集患者的临床及实验室检查资料，同时选取慢性活动性乙肝患者47例、健康体检者40例作为对照。确定研究对象后，采集研究对象静脉血3ml，分离血清保存待用。
2.在实验对象中选取3例肝癌患者血清和3例正常对照者血清，构建小RNA测序文库，基于illumina测序技术平台，进行单端测序，获得有差异表达的miRNAs，对差异表达miRNAs进行靶基因预测和候选靶基因的确定。
3.选取部分显著性差表达的miRNAs作为研究指标，采用qRT-PCR技术检测肝癌血清、慢性活动性乙肝血清和正常对照血清中miRNAs表达水平。根据qRT-PCR检测结果，初步确定肝癌患者血清差异表达miRNAs并作其与肝癌的logistic逐步回归分析，最后确定有效的差异表达miRNAs。分析最终入选的miRNAs与肝癌患者临床特征及实验室检测指标的相关性。
4.应用ROC曲线分析miRNAs对肝癌的诊断价值，包括灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值、阴性预测值等，评价肝癌传统标志物AFP单独及与miRNAs联合检测在肝癌的诊断中的价值。
5.统计学处理：采用SPSS16.0统计软件，实验数据以（-x±s）表示，采用单因素方差分析肝癌组、慢性活动性肝炎组和正常对照组之间miRNA的差异表达，P＜0.05有统计学意义。用logistic回归逐步分析有差异表达的miRNA(选入标准α=0.05，剔除标准α=0.10)，筛选出有诊断价值的miRNA，求出Logistic回归方程。用Spearman相关分析miRNA与各临床特征指标的关系，P＜0.05为差异具有统计学意义。使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析单个指标和多指标联合检测对肝癌的诊断价值。
结果：
1.在肝癌血清和正常对照血清中筛选出42个差异性表达miRNAs，其中35个miRNAs表达上调，7个miRNAs表达下调。部分差异表达miRNAs可能与基因转录、细胞代谢、细胞周期以及细胞凋亡等相关基因的调空有关。
2.肝癌组和慢性活动性乙肝组血清中miR-320c、miR-4429、miR-4532较正常对照组血清相对表达量有上升趋势，且差异具有显著性差异（P＜0.05）；miR-1290在三组血清中的相对表达量无显著性差异；肝癌组血清中miR-769-5p、miR-223-3P较慢性活动性乙肝组和正常对照组血清相对表达量有下降趋势，且差异具有显著性差异（P＜0.05）；慢性活动性乙肝组血清中miR-744-5p的相对表达量与肝癌组和正常对照组血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05），肝癌组血清中miR-744-5P的相对表达量与正常对照血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05）；慢性活动性乙肝组血清中miR-150-5p的相对表达量与肝癌组和正常对照血清相比，相对表达量上升且有显著性差异（P＜0.05）。
3.根据以上统计结果，将miR-320c、miR-769-5p、miR-223-3p、miR-744-5p、miR-4429共5个差异表达miRNA入选为logistic回归分析，最后将miR-769-5p和miR-4429共2个差异表达miRNA入选，并做回归方程：P=1/[1+e-(0.687-4.919X1+2.151X2)](方程中的X1、X2分别代表miR-769-5p和miR-4429的相对表达量)。miR-769-5p和miR-4429与肝癌患者临床病理在指标均无显著性相关（P＞0.05）。
4.miR-769-5p、miR-4429和AFP单项检测和联合检测在诊断肝癌中的ROC曲线分析：在单项检测中，miR-769-5p的AUC(曲线下面积)为0.803（95CI：0.691～0.914，P＜0.001），灵敏度最高；AFP的AUC为0.798（95CI：0.707～0.889，P＜0.001）；miR-4429的AUC为0.877（95CI：0.811～0.943，P＜0.001），特异性最好；在联合检测中，miR-769-5p联合miR-4429的AUC为0.874（95CI：0.806～0.942，P＜0.001）；miR-769-5p联合AFP的AUC为0.929（95CI：0.880～0.977，P＜0.001）；miR-4429联合AFP的AUC为0.934（95CI：0.888～0.981，P＜0.001）；三者联合检测的的AUC为0.956（95CI：0.917～0.995，P＜0.001），灵敏度和准确度均最高
结论：
通过二代测序技术发现肝癌血清中存在众多差异表达miRNAs，经qRT-PCR检测及logistic回归分析，筛选出miR-769-5p和miR-4429为肝癌的有效诊断指标，ROC分析显示其具有较好的灵敏度和特异性，具备成为肝癌生物标志物的潜能。传统肿瘤标志物AFP的灵敏度和特异性较低，联合与miR-769-5p、miR-4429可以提高肝癌诊断的敏感度、特异性，对肝癌的发现、诊断有重要价值。