【摘 要】
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病毒作为一种绝对细胞内寄生的微生物,其在宿主细胞内的有效增殖依赖于大量宿主因子的参与。猪δ冠状病毒（porcineδcoronavirus,PDCoV）是近几年新发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起新生仔猪的腹泻和死亡,给养猪业造成了一定的经济损失,针对该病目前尚无安全有效的疫苗和特效的治疗药物。筛选与PDCoV复制相关的宿主因子可以为开发抗PDCoV药物提供靶点。基于此,本研究利用CRISPR-C
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病毒作为一种绝对细胞内寄生的微生物,其在宿主细胞内的有效增殖依赖于大量宿主因子的参与。猪δ冠状病毒（porcineδcoronavirus,PDCoV）是近几年新发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起新生仔猪的腹泻和死亡,给养猪业造成了一定的经济损失,针对该病目前尚无安全有效的疫苗和特效的治疗药物。筛选与PDCoV复制相关的宿主因子可以为开发抗PDCoV药物提供靶点。基于此,本研究利用CRISPR-Cas9敲除系统,对猪全基因组进行了筛选,发现一种与内质网定位相关的多次跨膜蛋白TMEM41B可能参与PDCoV的复制。于是进一步利用si RNA干扰、过表达和TMEM41B敲除细胞系的构建对TMEM41B在PDCoV增殖中的作用进行了验证,并对其作用机制进行了研究。具体研究内容如下:1.PDCoV增殖相关宿主因子的筛选将针对猪全基因组的CRISPR-Cas9 sgRNA慢病毒文库转导LLC-PK1细胞,通过加压筛选获得杂合的全基因组敲除细胞文库。用PDCoV感染该细胞系,经过两轮筛选后,对存活的细胞提取基因组DNA进行测序分析,测序结果显示TMEM41B评分较高,提示该分子可能是PDCoV增殖过程中重要的宿主因子。2.干扰TMEM41B抑制PDCoV的增殖为了验证TMEM41B是否参与PDCoV的增殖,首先设计并合成了TMEM41B的干扰分子（si RNA）,转染至LLC-PK1细胞,24 h后接种PDCoV。利用RT-q PCR以及Western-blot检测发现,干扰TMEM41B抑制了PDCoV在LLC-PK1细胞上的增殖,说明TMEM41B与PDCoV在细胞中的增殖有关。3.过表达TMEM41B促进PDCoV的增殖进一步构建了TMEM41B的真核表达质粒,转染LLC-PK1细胞后接种PDCoV。利用RT-q PCR和Western-blot检测发现,过表达TMEM41B促进了PDCoV在LLC-PK1细胞上的增殖,说明TMEM41B确实参与了PDCoV在细胞中的增殖过程。4.敲除TMEM41B显著抑制PDCoV、TGEV和PEDV的增殖设计并合成针对猪源TMEM41B 1号、4号外显子的两对gRNA,分别构建至PX-459载体中,将构建好的质粒转染LLC-PK1细胞,经加压筛选和测序证实获得了2组TMEM41B敲除的细胞系KO-1（TMEM41B基因中插入1个碱基）和KO-2（TMEM41B基因缺失10个碱基）,Western-blot检测证实这两组细胞均不表达TMEM41B。CCK8试剂盒检测发现TMEM41B的敲除对细胞活性无明显影响。接种PDCoV后通过间接免疫荧光、TCID50和RT-q PCR检测发现,TMEM41B敲除后显著抑制PDCoV的增殖。在敲除细胞系上过表达TMEM41B后,PDCoV的增殖得到了一定程度的恢复。以上结果说明TMEM41B是与PDCoV增殖相关的重要宿主因子。在此基础上,利用TMEM41B敲除细胞系检测了TMEM41B敲除对TGEV和PEDV增殖的影响,间接免疫荧光结果显示TMEM41B敲除后显著抑制TGEV S蛋白和PEDV S蛋白的表达,说明敲除TMEM41B也能抑制TGEV和PEDV的增殖,而TGEV和PEDV与PDCoV同属冠状病毒科,由此推测TMEM41B可能是冠状病毒感染相关的重要宿主因子。5.TMEM41B主要参与PDCoV增殖周期中的复制阶段为了确定TMEM41B参与PDCoV增殖的具体机制,利用TMEM41B敲除细胞系分别检测了敲除TMEM41B对PDCoV吸附、侵入、复制及释放的影响。通过RT-q PCR检测,发现TMEM41B敲除对PDCoV增殖过程中的吸附阶段无明显影响,但显著抑制PDCoV负链RNA的合成;通过空斑实验检测发现TMEM41B敲除对PDCoV增殖过程中的侵入阶段无明显影响,但在一定程度上抑制了PDCoV的释放阶段。以上结果说明TMEM41B主要参与PDCoV增殖过程中的复制及释放阶段。6.TMEM41B通过影响双层囊泡形成参与PDCoV复制通过电镜观察敲除TMEM41B对PDCoV诱导的双层囊泡（Double membrane vesicles,DMV）形成的影响,结果发现LLC-PK1细胞敲除TMEM41B后,接种PDCoV不能诱导DMV形成,而野生型细胞能正常诱导DMV生成,并且Co-IP实验证实TMEM41B与DMV的支架蛋白PDCoV nsp4存在相互作用,同时发现PDCoV感染会导致TMEM41B在细胞内的分布由弥散型变为点状聚集型。以上结果说明TMEM41B可能是通过介导PDCoV复制复合体及DMV的形成,参与PDCoV的复制阶段,进而影响PDCoV的增殖。
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