论文部分内容阅读
目的：研究年龄和视觉经验的改变对大鼠视皮层(visualcortex，VC)中N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体亚单位NR2A、NR2B表达的影响，进一步研究视觉系统可塑性及其作用机制的分子基础。
内容：第一部分：观察从出生到生后90天的大鼠视皮层中N-甲基-D-天门冬氨酸受体功能亚单位NR2A与NR2B的表达随发育的变化，为研究视觉刺激对视皮层NR2A、NR28的表达调控机制做准备。第二部分：①观察关键期内正常发育大鼠与生后即进行暗饲养的大鼠视皮层中NR2A、NR2B的表达变化；②观察暗饲养对正常成年大鼠视皮层中NR2A、NR2B受体表达有无影响，从分子水平上研究视觉刺激与视觉系统可塑性的关系。
研究方法：第一部分：40只健康新生Wistar大鼠，雌雄不限，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心(天津)提供，随机分成8组，每组5只，正常饲养，分别于出生后0天、14天、21天、28天、35天、45天、60天、90天麻醉、灌注、固定、开颅、冠状切取后部脑组织，置于40％多聚甲醛中4℃周定24-48h后，按常规石蜡包埋程序包埋。行5μm冠状连续切片后，进行常规HE和免疫组织化学方法染色。显微镜下观察NR2A、NR2a在视皮层的表达情况。Olympus显微摄像系统采集图片，图像分析软件进行累计光密度(IOD)值测定。对IOD值进行分析和比较，实验数据以均数±标准差(-x±s)表示，用SsPS11.5软件包处理，发育不同时限的光密度值采用方差分析。第二部分：①将刚出生的5只whister大鼠连同母鼠一起投入暗箱内饲养，幼鼠自出生至取材未接受过视觉刺激；对照组为5只相同条件下出生的幼鼠，饲养环境有12h白天/黑夜交替，21天灌注取材。②生后80天(P80)健康的正常光线环境下成长Wistar大鼠10只，随机分成2组，每组5只，视觉剥夺组投于暗室内饲养10d后灌注取材；对照组一直生活在12h亮/暗循环环境的大鼠10d后灌注取材。IOD值的采集和分析方法同前，视觉剥夺组与正常组间采用成组设计的t检验进行统计分析。
结果：第一部分：①HE染色结果：视皮层细胞构筑清晰，层次分明，各层神经元排列整齐。②免疫组织化学结果：光镜下NR2A、NR2B的阳性反应产物呈棕黄色点状或颗粒状，视皮层17区各层均可见NR2A、NR2B染色阳性细胞，阳性细胞多为锥体细胞和颗粒细胞。③发育不同时限大鼠VC中NR2A、NR2B的表达：比较发育不同时限大鼠VC中NR2A、NR2B的IOD值，可以看出NR2A的表达随年龄呈发育性变化，在出生时的视皮层中即已存在，但含量较少，其IOD值为9.00±3.55，随后表达缓慢上升，P35天达峰值，为203.75±9.93，后略有下降，至成年后维持于较高水平，单因素方差分析各年龄段间NR2A的表达具有显著差异(P<0.05)；NR2B的表达亦随年龄呈发育性变化，其在出生时的视皮层也已存在，表达量为56.59±7.36，远高于NR2A的表达，并迅速升高，生后14天NR2B达到峰值，IOD值为223.94±63.34。继而逐渐下降，至第60天后趋于平稳，单因素方差分析各年龄段间NR2B的表达具有显著差异。(P<0.05)。④出生后不同天龄NR2A、NR2B表达比值的变化：伴随发育受体复合物的组成由NR2B占主导变为NR2A占主导。NR2A与NR2B的比值由P14大鼠睁眼时的0.07±0.02逐渐上升至P35天的1.33±0.13，后略有下降，至成年后维持于较高水平，单因素方差分析各年龄段间NR2A与NR2B的比值具有显著差异(P<0.05)。第二部分：(1)视觉剥夺对关键期内大鼠视皮层内NR2A、NR2B表达的影响：①视觉剥夺组与正常组NR2A表达分析：生后即进行暗饲养的视觉剥夺组大鼠NR2A的IOD值为114.03±12.21，较正常发育组124.63±11.76表达明显减少(t=3.567，P<0.05)。②视觉剥夺组与正常组NR2B表达分析：生后即进行暗饲养的视觉剥夺组大鼠NR2B的IOD值为235.96±32.05，明显高于正常组的200.18±39.91(t=-6.739，P<0.05)。③视觉剥夺组与正常组NR2A、NR2B表达比值的变化分析：生后即进行暗饲养的视觉剥夺组大鼠NR2A与NR2B的IOD比值为0.09±0.04，低于正常组的0.13±0.06(t=4.45，P<0.05)。(2)视觉剥夺对成年大鼠视皮层内NR2A、NR2B表达的影响：成年暗饲养大鼠视皮层中NR2A、NR2B的IOD值与其正常成年大鼠视皮层中的IOD值相比，差异无统计学意义。
结论：第一部分：本结果显示视皮层中NR2A、NR2B表达量的变化与视觉发育可塑性关键期的起始与终止在时间上具有一定程度的同步性，NR2A与NR2B的比值不断增大，由NR2B占主导变为NR2A占主导，提示生后NR2A、NR2B的表达的发育性时间差异可能是影响可塑性关键期起始的一个重要分子基础。第二部分：①对于关键期内的大鼠，视觉剥夺能够阻止NR2A的增加，并使其表达减少；同时，阻止NR2B的减少使其表达增多，降低NR2A/NR2B，说明在视觉发育的关键期内NMDA受体亚单位的组成和动态表达受视觉经验的调节。②在本研究中，没有观察到成年大鼠视觉剥夺组与正常组视皮层中NMDA受体构成随视觉经验发生改变。说明成年动物视觉系统变得更加稳固，视觉经验对皮层回路的可塑性影响减少。