论文部分内容阅读
马铃薯是继水稻、小麦、玉米之后我国的第四大主粮。随着马铃薯的种植模式的改变和种植水平的提高，马铃薯的产量和品质也在不断的提升，但在马铃薯生产过程中受到许多病虫的为害，影响马铃薯的产量和品质。马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)就是其中之一，PSTVd极具侵染性，从休眠期到成熟期整个过程都能侵染，且侵染率极高。目前我国部分区域已检测到PSTVd的存在，一般病毒可以通过茎尖剥离技术剔除，但是PSTVd却很难依靠茎尖脱毒汰除，其中种薯是携带该类病毒的重要载体，目前还没有可以完全根除的方法，给马铃薯生产带来巨大挑战。因此，PSTVd的检测工作任重道远。本研究通过qRT-PCR检测技术，研究PSTVd在不同马铃薯品种之间、不同部位及其继代体的相对含量的差异情况，为抗PSTVd马铃薯品种的筛选、培育奠定基础，对马铃薯种薯的繁育以及PSTVd的防控具有现实意义。研究结果如下：
1.建立了PSTVd的qRT-PCR检测方法：根据已知PSTVd基因序列特点，设计并验证了三组引物和内参基因，建立了标准曲线，根据其扩增效率、线性关系等从此中筛选出最合适本实验的引物：P120/P236、内参基因Actin，建立了PSTVd的qRT-PCR检测方法，为PSTVd相对含量的后续研究奠定了基础。
2.PSTVd在所侵染的不同马铃薯品种组培苗的相对含量存在差异。利用PSTVdRNA浸蘸的方式进行脱毒马铃薯组培苗侵染，在被侵染的五个马铃薯品种中，冀张薯12(J12t)中PSTVd的相对含量显著高于其他四个品种，其次依次是青薯9号(09-170t)、夏波蒂(09-02t4)、冀张薯8号(22-83t)、克新1号(克t4)，其相对含量分别为冀张薯12(J12t)的9.79%、0.2%、0.15%和0.1%。
3.同一马铃薯品种组培苗的不同部位中PSTVd的相对含量存在差异。将侵染阳性的马铃薯组培苗按茎尖、茎段分开进行继代组织培养。结果表明：冀张薯12(J12t)的不同继代培养体间茎尖的PSTVd相对含量均显著高于茎段；青薯9号(09-170t)不同继代培养体间茎尖的PSTVd相对含量均显著高于茎段；冀张薯8号(22-83t)的继1、3、4代，PSTVd在茎段的相对含量显著高于茎尖，而在继2代、继5代PSTVd在茎尖的相对含量则显著高于茎段；克新1号(克t4)继1-4代PSTVd在茎尖的相对含量均显著低于茎段，但在继5代，茎尖的PSTVd相对含量则显著高于茎段；夏波蒂(09-02t4)继1代、继2代茎尖的PSTVd相对含量显著低于茎段，而在继3-5代，茎尖PSTVd相对含量显著高于茎段。五个马铃薯品种中，冀张薯12(J12t)和青薯9号(09-170t)茎尖的PSTVd相对含量均高于茎段，因此茎尖脱毒技术并不适用于该品种马铃薯。
4.对继代培养的每一代感病马铃薯品种进行qRT-PCR检测，比较继代培养后五个马铃薯品种体内PSTVd相对含量的变化，结果表明：继代培养后PSTVd在夏波蒂(09-02t4)存在茎尖、茎段积累现象，在克新1号(克t4)和冀张薯8号(22-83t)中只存在茎尖积累现象，克新1号(克t4)茎段继5代后无明显差异，而冀张薯8号(22-83t)和青薯9号(09-170t)茎段继代培养后PSTVd含量下降，继代培养后冀张薯12(J12t)茎尖、茎段中的PSTVd相对含量降低。
本研究应用qRT-PCR技术检测感病马铃薯品种，通过比较PSTVd在不同品种之间的表达差异情况及其继代培养体内的含量变化来筛选培育抗性品种，为PSTVd防治奠定理论基础。
1.建立了PSTVd的qRT-PCR检测方法：根据已知PSTVd基因序列特点，设计并验证了三组引物和内参基因，建立了标准曲线，根据其扩增效率、线性关系等从此中筛选出最合适本实验的引物：P120/P236、内参基因Actin，建立了PSTVd的qRT-PCR检测方法，为PSTVd相对含量的后续研究奠定了基础。
2.PSTVd在所侵染的不同马铃薯品种组培苗的相对含量存在差异。利用PSTVdRNA浸蘸的方式进行脱毒马铃薯组培苗侵染，在被侵染的五个马铃薯品种中，冀张薯12(J12t)中PSTVd的相对含量显著高于其他四个品种，其次依次是青薯9号(09-170t)、夏波蒂(09-02t4)、冀张薯8号(22-83t)、克新1号(克t4)，其相对含量分别为冀张薯12(J12t)的9.79%、0.2%、0.15%和0.1%。
3.同一马铃薯品种组培苗的不同部位中PSTVd的相对含量存在差异。将侵染阳性的马铃薯组培苗按茎尖、茎段分开进行继代组织培养。结果表明：冀张薯12(J12t)的不同继代培养体间茎尖的PSTVd相对含量均显著高于茎段；青薯9号(09-170t)不同继代培养体间茎尖的PSTVd相对含量均显著高于茎段；冀张薯8号(22-83t)的继1、3、4代，PSTVd在茎段的相对含量显著高于茎尖，而在继2代、继5代PSTVd在茎尖的相对含量则显著高于茎段；克新1号(克t4)继1-4代PSTVd在茎尖的相对含量均显著低于茎段，但在继5代，茎尖的PSTVd相对含量则显著高于茎段；夏波蒂(09-02t4)继1代、继2代茎尖的PSTVd相对含量显著低于茎段，而在继3-5代，茎尖PSTVd相对含量显著高于茎段。五个马铃薯品种中，冀张薯12(J12t)和青薯9号(09-170t)茎尖的PSTVd相对含量均高于茎段，因此茎尖脱毒技术并不适用于该品种马铃薯。
4.对继代培养的每一代感病马铃薯品种进行qRT-PCR检测，比较继代培养后五个马铃薯品种体内PSTVd相对含量的变化，结果表明：继代培养后PSTVd在夏波蒂(09-02t4)存在茎尖、茎段积累现象，在克新1号(克t4)和冀张薯8号(22-83t)中只存在茎尖积累现象，克新1号(克t4)茎段继5代后无明显差异，而冀张薯8号(22-83t)和青薯9号(09-170t)茎段继代培养后PSTVd含量下降，继代培养后冀张薯12(J12t)茎尖、茎段中的PSTVd相对含量降低。
本研究应用qRT-PCR技术检测感病马铃薯品种，通过比较PSTVd在不同品种之间的表达差异情况及其继代培养体内的含量变化来筛选培育抗性品种，为PSTVd防治奠定理论基础。