mIL-12基因转染及对人卵巢癌免疫抗肿瘤作用实验研究

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:godboy549321336
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目的:通过mIL-12基因转染的成功性初步探究其在卵巢癌中的免疫抗肿瘤机制。方法:1、脂质体转染技术将含有小鼠IL-12全长基因的质粒转染至卵巢癌细胞株SKOV3(SKOV3/IL-12);进行转染后细胞筛选,在相差显微镜下观察细胞形态的变化。2、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测SKOV3/IL-12、SKOV3/neo和SKOV3细胞培养上清中IL-12蛋白及SKOV3/IL-12与脾细胞悬液共同作用后INF-γ蛋白的表达。MTT法检测对细胞株SKOV3细胞的抑制率。3、逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)半定量法测定SKOV3/IL-12+s(脾细胞)0、12、24、36、48、60小时VEGFmRNA含量;ELISA方法测定细胞培养上清液中VEGF蛋白含量; 4、将SKOV3细胞接种于裸鼠腹腔,待成瘤及腹水形成后,腹腔注射SKOV3/IL-12,同时皮下给与顺铂,观察腹水控制及肿瘤坏死情况,进行小鼠脾脏NK细胞活性测定及FACS检测脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+、CD8+的数量;ELISA法检测裸鼠血清中IL-12的表达。免疫组化检测肿瘤组织中VEGF的表达。结果:1、筛选出现多个阳性细胞克隆,转染前后细胞形态无变化。2、转染后SKOV3/IL-12细胞48、60h SKOV3/IL-12细胞中上清中IL-12蛋白表达量(473±38)pg/ml、(522±32)pg/ml与SKOV3/neo的(16±1.3)pg/ml、(14±1.1)pg/ml及SKOV3(16±1.2)pg/ml、(17±2)pg/ml比较,差异有极显著性(p<0.05)。3、SKOV3/IL-12表达的IL-12具有生物学活性,能使效应细胞分泌INF-γ;SKOV3/IL-12与脾细胞作用后产生INF-γ,12小时即出现INF-γ的表达,作用24小时表达量高,约196±16.8 pg/ml,持续至60小时,较未转染组高,比较有统计学意义,P<0.05;SKOV3/IL-12与脾细胞共同作用12h后, /IL-12细胞增殖受抑,与SKOV3/neo及SKOV3细胞比较,差异均有统计学意义p<0.05。4、SKOV3/IL-12细胞与脾细胞作用12后即出现VEGF mRNA表达抑制,24小时达到高峰,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);培养24h后上清中VEGF蛋白含量减少,与对照比较差异有显著性;。5、顺铂与SKOV3/IL-12细胞SKOV3治疗组裸鼠腹水量明显减少,肿瘤有坏死,周围可见似包膜样物形成,NK细胞活性增强,FACS检测脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+、CD8+的数量增多,与对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05);顺铂与SKOV3/IL-12细胞联合治疗组裸鼠血清中IL-12表达量(491.87±54.786)pg/ml与单独顺铂组的(70.25±17.376)pg/ml和生理盐水组的(65.50±8.569)pg/ml比较,差异均有统计学意义(p<0.05);结论:1、脂质体转染技术能将IL-12基因有效地导入SKOV3细胞,并表达有活性的IL-12蛋白,可诱导效应细胞脾细胞分泌INF-γ;2、SKOV3/IL-12与效应细胞脾细胞作用后产生的INF-γ能在核酸水平下调VEGF并能抑制VEGF蛋白的表达;3、SKOV3/IL-12联合顺铂能有效控制荷瘤裸鼠腹水,抑制肿瘤生长,并能增强NK细胞的活性,小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+、CD8+的数量较对照组的增多;IL-12可通过增强NK细胞活性,诱导INF-γ产生,INF-γ能在核酸及蛋白质水平下调VEGF的表达而实现其抗卵巢癌的作用。
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