论文部分内容阅读
【课题背景】 脓毒症(Sepsis)是一类由感染引起的全身性免疫反应综合征，同时伴有两个或以上序贯性器官功能障碍（sepsis-related or sequential organ failure assessment SOFA）。在脓毒症的发生主要由病原微生物的入侵开始，病原体可产生大量的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)，从而导致机体出现过度炎症反应、同时伴有凝血系统、代谢和微循环功能障碍。血液中LPS不仅可以引起机体的炎症反应，还可以使大量的血小板活化，从而引发弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)，进而发展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。因此如何阻止脓毒症的进展，并改善各靶系统和靶器官的功能是临床研究的热点和难点之一。血小板形态改变和功能密切相关，而血小板作为凝血系统的重要参与者，在脓毒症的发生和发展过程中起着非常重要的作用。血小板形态和功能变化是凝血功能改变的前提，确切了解脓毒症中血小板形态和功能改变的机制将有助于寻找潜在的干预靶点。但目前对于脓毒症中血小板形态和功能变化的机制研究尚处在初级阶段。 研究发现外源性一氧化碳(Carbon monoxide,CO)具有抑制LPS所引起的血小板的粘附和凝聚的效应。磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）是一类磷酸化磷脂酰肌醇及其衍生物的激酶，可以通过激活细胞内的鸟嘌呤核苷酸转换因子(Guanine nucleotide exchange factors,GEFs))和 GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins,GAPs)激活GTP酶(RhoA,Rac1和Cdc42)，从而控制细胞骨架的重构。神经元发育调控蛋白(Neuron-associated developmentally regulated protein,Nadrin)是一类GTP酶活化蛋白(GAPs),它可以通过活化GTP酶(RhoA,Rac1和Cdc42)对血小板肌动蛋白丝(actin filament,AF)的聚合起到调节的作用，进而调控血小板的形态和功能。凝溶胶蛋白(Gelsolin)是一个肌动蛋白结合蛋白，在激活的状态下和肌动蛋白结合并对肌动蛋白丝进行剪切和封端；而失活状态下的Gelsolin与肌动蛋白丝分离，便于肌动蛋白丝的多聚化。 有相关研究表明，PI3K、Nadrin、Rac1及Gelsolin均参与了体细胞的骨架重构，且都存在于血小板中。因此从理论上推测，PI3K、Nadrin、Rac1以及Gelsolin参与了脓毒症血小板的活化。但目前研究仅限于PI3K可促进血小板及其他体细胞的骨架蛋白重构，但对于其机制尚无深入研究，且对于外源性CO对血小板骨架蛋白重构的影响尚无相关报道。基于以上研究基础，本研究主要探讨外源性CO通过影响LPS刺激下血小板的PI3K、Nadrin、Rac1以及Gelsolin的活化状态调节血小板形态和功能，进而影响脓毒症中血小板介导的血栓和止血作用。这可能为脓毒症中抗凝血提供一个解决问题的新思路。 【研究目的】 本研究旨在研究过PI3K-Nadrin-Rac1-Gelsolin信号通路在脓毒症血小板骨架重构中的作用，并初步探讨外源性CO通过PI3K-Nadrin-Rac1-Gelsolin信号通路对脓毒症中血小板骨架重构的影响，并进一步探讨外源CO对脓毒症中的血小板形态和功能的影响。 【研究方法】 本研究采用LPS刺激血小板的体外模型模拟脓毒症中的血小板，观察LPS对血小板活化（粘附、凝聚和形态的改变）的诱导作用，并对其采用不同浓度的CORM-2(外源性CO释放分子)进行干预，观察CORM-2对LPS诱导的血小板活化的抑制作用。同时采用荧光分子修饰的鬼笔环肽标记血小板的肌动蛋白丝，根据荧光亮度计算血小板的粘附率；用ADP作为诱导剂，检测血小板的聚集率；采用流式细胞实验检测血小板表面粘附因子P-选择素（P-selectin）的表达量；采用罗丹明偶联的鬼笔环肽标记血小板的肌动蛋白丝，用激光共聚焦显微镜进行观察、拍照；采用扫描电镜及原子力显微镜观察血小板表面的形态和伪足数量；最后采用Western Blot检测PI3K、Nadrin、Rac1及Gelsolin的表达。并使用PI3K抑制剂(Wortmannin,LY294002)和Rac1抑制剂(Y27632)对活化血小板进行干预，再次检测血小板的粘附率、聚集率、P-选择素的表达量、肌动蛋白丝的表达量、血小板表面的伪足数量；及相关蛋白PI3K、Nadrin、Rac1及Gelsolin的表达，进行统计学分析。 【研究结果】 LPS可以增加血小板的粘附率，而外源性CO可以浓度依赖的方式降低LPS所诱导的血小板的粘附率和聚集率；LPS可以促进血小板表面粘附因子P-选择素（P-selectin）的表达，而外源性CO则会减少LPS所诱导的P-选择素的表达量的增加；激光共聚焦显微镜结果提示：LPS能够促进血小板中肌动蛋白丝的多聚化，而外源性CO则可以缓解肌动蛋白丝的多聚化；扫描电镜及原子力显微镜结果提示：LPS刺激下血小板表面的伪足数量高于对照组，而CORM-2组的血小板伪足数量有明显的减少；Western blot结果表明LPS可以促进血小板内Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和Gelsolin的磷酸化，而CORM-2可以减少LPS增加的Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和 Gelsolin的磷酸化；PI3K抑制剂(Wortmannin, LY294002)也能减少LPS所促进的Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和Gelsolin的磷酸化，用Rac1抑制剂(Y27632)也能减缓LPS促进的Gelsolin的磷酸化；同时，PI3K抑制剂(Wortmannin, LY294002)和Rac1抑制剂(Y27632)也能降低LPS诱导的血小板活化后聚集率、粘附率、P选择素表达量和肌动蛋白表达量，同时减少血小板伪足的生成量。 【研究结论】 1.外源性CO可以减缓脓毒症中血小板的活化(粘附、凝聚和形态的改变)。 2.PI3K-Nadrin-Rac1信号通路介导了脓毒症中血小板的激活，而外源的CO则可以通过缓解PI3K-Nadrin-Rac1信号通路的激活缓解脓毒症中血小板的细胞骨架的重构。 3.gelsolin介导了PI3K-Nadrin-Rac1信号通路调控的脓毒症中血小板的活化，而外源性CO也正是通过抑制脓毒症中gelsolin的磷酸化而起到缓解血小板细胞骨架重构的作用。