论文部分内容阅读
背景与目的泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-protesome systerm, UPS)通过介导细胞内多种蛋白的降解而参与细胞生命过程的调节。蛋白酶体是肿瘤治疗的重要靶点,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡具有敏感性差异。本课题组在前期实验中首次发现ATP浓度对26S蛋白酶体活性具有双向调控作用,并首创26S蛋白酶体活性-ATP浓度模式图。ATP是内源性小分子,动物不同组织的ATP浓度不一样,推测蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡敏感性受细胞内ATP浓度调控。本文旨在证明细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的敏感性,为细胞内ATP浓度调控蛋白酶体功能提供依据。方法与结果1.细胞内ATP浓度的调控选用前期实验已明确产能途径的K562细胞(以糖酵解为主,糖的有氧氧化为辅)和H460细胞(以糖的有氧氧化占绝对优势)为研究对象。通过干预细胞培养基的葡萄糖含量、使用腺苷供能(Adenosine,Ade)、抑制细胞的产能途径【氧化磷酸化抑制剂寡霉素(Oligmycin,OLIG);糖酵解抑制剂2-脱氧-右葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2DG)】等方式进行调控。前期实验证明细胞内ATP浓度的调控是可行的。2.细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的研究2.1调控细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制诱导K562细胞死亡敏感性的影响2.1.1右糖培养基与无糖培养基对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的影响右旋葡萄糖是细胞内ATP的主要来源物质,正常培养基的葡萄糖是右旋葡萄糖,培养细胞时细胞内ATP浓度高,而使用无糖培养基时细胞内ATP浓度低。①不同浓度的MG132(0～20μM)和MG262(0～1μM)分别在右糖培养基与无糖培养基的细胞作用不同时间,Annexin V-FITC流式细胞术检测显示MG132与MG262在右糖培养基诱导的细胞死亡比无糖培养基细胞严重,并呈剂量依赖关系,MG132 10μM作用12小时细胞死亡率相差24.1%,MG132 20μM作用24小时细胞死亡率相差59.8%,MG262 1μM作用12小时死亡率相差18.2%②MG262 1μM分别作用于右糖培养基与无糖培养基细胞,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学改变动态观察(相差100X),时程12小时。右糖培养基细胞“出芽”、凋亡小体形成、细胞破裂等细胞死亡形态学改变明显,无糖培养基细胞胞膜基本完整结果说明细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制剂诱导的细胞死亡敏感性存在影响,细胞内ATP浓度高时蛋白酶体诱导的细胞死亡严重。2.1.2右糖培养基与左糖培养基对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响左旋葡萄糖是右旋葡萄糖的对映异构体,不能代谢供能,用于平衡细胞渗透压。①MG132(5μM)、MG262(1μM)分别在右糖培养基与左糖培养基细胞作用9小时、18小时,流式细胞术检测显示MG132与MG262在右糖培养基诱导的细胞死亡比左糖培养基严重,药物作用9小时细胞死亡率相差约6%,药物作用18小时细胞死亡率相差约30%,两药物各自在右糖培养基与无糖培养基的细胞死亡率比较,具有统计学意差义,p<0.01。②MG132(5μM)分别在右糖培养基与左糖培养基细胞作用12小时,电子透射显微镜细胞超微结构图像显示右糖培养基细胞死亡改变明显:核浓缩,染色质呈新月状、团块状聚集在核膜周围或核碎裂,胞浆空泡化,细胞膜破裂;左糖培养基细胞死亡改变表现为线粒体肿胀,凋亡小体形成,胞膜完整。上述结果可排除渗透压对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡敏感性的影响,支持细胞内ATP浓度高时蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡严重。2.1.3 Ade上调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响①实验同时采用无糖培养基与右糖培养基,分对照组,Ade组,MG262组,Ade+ MG262组,药物作用24小时,流式细胞术检测显示,右糖培养基细胞死亡率50.7%～82%,无糖培养基细胞死亡率15.8%～36.3%;Ade+MG262组与MG262组比较,在无糖培养基表现为细胞死亡加重,两组细胞死亡率比较,差异有统计学意义,p<0.01;在有糖培养基表现为细胞死亡由早期凋亡走向晚期凋亡,细胞死亡百分率基本不变。②实验采用右糖培养基,分对照组,Ade组,MG262组,Ade+MG262组,MG132组、Ade+MG132组,,药物作用18小时, LDH测定值MG262组431.31 U/L,Ade+MG262组939.3 U/L,MG132组718.85 U/L、Ade+MG132组1098.85 U/L,,Ade+MG132组与MG132组LDH值比较,差异有统计学意义,p<0.01,Ade+MG262组与MG262组LDH值比较,差异有统计学意义,p<0.01。结果表明Ade上调细胞内ATP时,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡加重。2.1.4 OLIG下调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响。①OLIG在无糖培养基下调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的影响实验采用无糖培养基,分对照组、OLIG组、Ade组、OLIG+Ade组、MG132组、MG132+OLIG组,药物作用12小时,流式细胞术检测显示OLIG组细胞死亡率约40%,OLIG+Ade组未见细胞死亡,MG132组细胞死亡率35.3%,OLIG+MG132组与OLIG组细胞死亡率基本相同。②OLIG在有糖培养基下调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的影响实验采用有糖培养基,分对照组,OLIG组,MG262组,OLIG+MG262组、MG132组,OLIG+MG132组,药物作用15小时,Annexin V-FITC流式细胞术检测显示,OLIG+MG262组细胞死亡率33.63%,MG262组细胞死亡率63.7%,两组细胞死亡率比较,差异有统计学意义,p<0.01;OLIG+MG132组细胞死亡以早期凋亡为主,MG132组细胞死亡以晚期凋亡为主。上述结果表明OLIG在无糖培养基下调细胞内ATP时,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡敏感性基本无变化;而OLIG在右糖培养基中下调细胞内ATP时,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡减轻。2.1.5 2DG下调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响实验采用有糖培养基,分对照组、Ade组、2DG组,2DG+MG132组,2DG+Ade+MG132组,药物作用12小时,流式细胞术检测显示MG132组细胞死亡率56.15%,2DG+MG132组细胞死亡率24.75%,2DG+MG132组细胞死亡率13.7%,2DG+Ade+MG132组细胞死亡率49.8%。实验结果表明2DG在右糖培养基中下调细胞内ATP时蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡减轻,而使用Ade上调细胞内ATP时蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡加重,蛋白酶体诱导的细胞死亡敏感性随ATP浓度的改变而改变。2.2调控ATP浓度对蛋白酶体抑制诱导H460细胞死亡敏感性的影响2.2.1 OLIG下调细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响实验采用右糖培养基,分对照组、OLIG组、MG132组、OLIG+MG132组,药物作用6小时,流式细胞术检测显示MG132组细胞死亡率10.23%,OLIG+MG132组细胞死亡率30.27%,OLIG+MG132组与MG132组细胞死亡率比较,p<0.05。2.2.2 2DG下调细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响①实验采用右糖培养基,分对照组、2DG组、MG132组、2DG+MG132组,药物作用12小时,流式细胞术检测显示MG132组细胞死亡率20.27%,2DG+MG132组细胞死亡率15%%,2DG+MG132组与MG132组细胞死亡率比较,差异有统计学意义,p<0.05。②实验采用右糖培养基,分对照组、2DG组、MG132组、2DG+MG132组,药物作用12小时, LDH测定值MG132组373U/L, 2DG+MG132组124U/L,2DG+MG132组与MG132组LDH测定值比较,差异有统计学意义,p<0.05。上述结果显示H460细胞内ATP下调时蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡变化不一致,H460细胞的产能途径以有氧氧化占绝对优势,使用OLIG抑制氧化磷酸化时细胞内细胞内ATP浓度大幅度下调,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡加重,而2DG使H460细胞内ATP小幅度下调,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡减轻。结论1.细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的敏感性。2.细胞内ATP浓度双向调控蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡。