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海洋生物中存在大量化学结构新颖、生物活性特殊、陆地生物无法比拟的活性物质。在国家“863”项目的支持下，我们实验室与第二军医大学海洋药物研究中心合作对海洋来源的化合物进行了抗肿瘤作用筛选，从海洋生物黑乳海参中提取分离得到具有显著抗肿瘤活性的三萜皂苷类化合物CU306。本研究系统阐明该化合物具有明显的体内外抗肿瘤活性，并对其作用机制进行深入研究。
我们采用磺酰罗丹明B(SRB)法检测CU306对29株肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用。结果显示CU306对各种组织来源的肿瘤细胞株均表现出普遍的细胞毒作用，其平均IC50值为2.44μM。CU306还对3株多药耐药细胞株(K562/A02、KB/VCR和MCF7/ADR)及相应的亲本细胞株表现出同等程度的生长抑制作用，平均耐药因子(RF)约为1，显著低于依托泊甙(VP16)、阿霉素(ADR)和长春新碱(VCR)的RF，表明CU306具有良好的抗多药耐药作用。并且，TUNEL法和DNALadder表明CU306能够诱导肿瘤细胞发生凋亡，并激活凋亡相关蛋白caspase-8、caspase-3和PARP蛋白。此外，我们进一步评价了CU306的体内抗肿瘤作用，结果证实CU306能显著抑制小鼠S-180肉瘤和H22肝癌肿瘤，以及人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤的生长。这些结果表明CU306在体内外均可发挥较好的抗肿瘤作用。
以此为基础，我们对CU306的抗肿瘤机制进行了深入研究。DNA拓扑异构酶(topoisomerase，Topo)具有重要的细胞生物学功能，已经成为抗肿瘤药物重要的作用靶点。本研究应用多个无细胞体系和细胞体系模型对CU306的Topo抑制作用进行多方位和多层次的研究和确证，以阐明CU306抑制TopoII的具体机制。PBR322解螺旋实验显示CU306仅在高浓度(125μM)时能抑制TopoI的催化活性，但DNA切割实验和Invivo Complex Of Enzyme(ICE)实验均表明CU306不能稳定TopoI-DNA可切割复合物，提示CU306的作用机制不同于喜树碱类化合物，CU306对TopoI的抑制作用可能是一种非特异性的抑制作用。与此形成对比的是，PBR22解螺旋反应和kDNA去连环实验均表明CU306能够剂量依赖性地抑制TopoII的活性；TARDIS实验和ICE实验进一步证明CU306能够稳定TopoII-DNA形成的可切割复合物；CU306还能诱导HL-60细胞DNA双链断裂并诱导DNA双链断裂分子标志γ-H2AX蛋白水平升高，并且能被TopoII催化抑制剂阿克拉霉素逆转。这些结果表明CU306是新的TopoII毒剂，TopoII是CU306的作用靶点。
我们进一步研究CU306对TopoII的各个催化环节的影响。首先，DNA伸展实验和溴乙锭取代实验显示CU306不能嵌入DNA；其次，DNA荧光偏振实验和DNA迁移实验表明CU306能抑制TopoII与DNA的非共价结合，计算机模拟分子对接技术分析表明，CU306与酶结合形式和DNA很相似，能够很好的结合于DNA结合结构域，可能以此来与DNA竞争结合TopoII的DNA结合结构域，从而阻止酶与DNA的结合；再次，采用DNA切割/再连接实验证明，CU306能增强TopoII对前链和后链DNA的切割，125μMCU306对前链切割的增强作用达到了1.8倍，25μM时的增强作用为1.3倍；但对后链的切割增强作用较前链作用略弱，125μMCU306对后链切割的增强作用达到了1.6倍，25μM时的增强作用为1.2倍。CU306也能抑制前链和后链的再连接，CU306125μM，25μM，5μM和1μM对前链连接的抑制率分别为90％，54％，38％和22％，同样浓度CU306对后链连接的抑制率分别为69％，41％，11％和0。这一结果表明，CU306对前链和后链的作用有一定程度的选择性，即对前链的切割/再连接作用要强于对后链的切割/再连接作用。这一作用与经典TopoII抑制剂VP16的作用有明显差异，后者对前、后链的作用几乎一致。在200μM时，VP16对前链和后链DNA链的切割作用分别增强了1.9倍和1.8倍，对DNA前链和后链的再连接的抑制率分别为91％和90％。最后，CU306虽然可以直接与人TopoIIαATPase结构域结合，但不能抑制TopoII的ATPase水解活性；分子对接结果显示，由于CU306空间结构较大，不能结合于TopoIIαATPase结构域中的ATP结合口袋，而只是附着于ATP结合口袋附近，因此CU306虽然能与hTopoII蛋白相互结合，却并不影响TopoII的ATP水解活性。以上研究显示，CU306能够模拟DNA结构与TopoII的DNA结合结构域结合，抑制酶与DNA的非共价结合，并影响酶对DNA链的切割/再连接。CU306抑制TopoII作用的分子机制明显不同于依托泊甙。
由于CU306的结构类似物在我课题组的研究中表现出良好的抗新生血管生成作用，因此我们对CU306的抗新生血管生成作用进行了研究。结果表明，CU306对新生血管生成的三个主要步骤：人微血管内皮细胞HMEC-1的增殖、迁移、管腔形成都有很强的抑制作用，其作用效果呈现明显的剂量依赖性。CU306对大鼠动脉环微血管生成也具有良好的抑制作用，并且在CU306治疗的人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤组织切片上也观察到肿瘤组织内微血管数量显著减少。表明CU306对于新生血管生成也具有显著的抑制活性。
综上所述，本研究发现海洋来源的化合物CU306具有较强的体内外抗肿瘤活性，并对多株耐药细胞株具有明显的生长抑制作用，能诱导肿瘤细胞发生凋亡。机理研究表明，CU306是一个新的DNA非嵌入性TopoII毒剂，能抑制TopoII与DNA的非共价结合，并影响ToppII介导的DNA链的切割/连接，其对前链的切割/连接的影响要强于对后链的切割/连接的影响，继而能够引起显著的DNA双链断裂。最后对CU306抑制肿瘤新生血管生成作用研究表明，CU306能显著抑制肿瘤新生血管的生成。