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鹅不食草为菊科植物石胡荽（Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.）的全草，具有祛风通窍、解毒消肿的功效，传统上用于治疗鼻炎、疟疾、哮喘等。鹅不食草中含有多种化学成分，如挥发油类、甾体类、黄酮类、萜类、有机酸等。近年来有研究表明鹅不食草具有良好的抗炎活性，但其抗炎活性成分，以及具体的抗炎机制尚未完全阐明。本课题主要利用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，研究鹅不食草中单体化合物的抗炎活性及其发挥抗炎作用的分子机制，以阐明其抗炎活性物质基础。
首先对前期从鹅不食草中分离鉴定得到的43个单体化合物进行了初步的体外抗炎活性评价，采用MTT法评价化合物细胞毒性的同时，通过Griess法检测化合物对小鼠巨噬细胞释放炎症介质NO的影响，根据结果优选出两个代表性活性化合物，并对这两个活性化合物进行深入研究。通过ELISA法来检测活性化合物对炎症介质前列腺素E2（PGE2）和炎症因子TNF-α以及IL-6过量释放的下调作用；使用Western Blot法来检测这两个化合物对炎性蛋白iNOS和COX-2的高表达和对NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解以及对MAPK通路中的ERK、JNK和p38蛋白磷酸化的调控作用。
在分离鉴定得到的43个单体化合物中，MTT实验结果显示，arnicolide B和arnicolide C分别在低于6.25μM和25μM浓度时对RAW264.7无明显的细胞毒性；Griess法实验结果表明，arnicolide B和arnicolide C对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质NO均具有显著的抑制作用。其中有些化合物在100μM时对炎症介质NO的释放有抑制活性，但进行MTT实验后，结果表明这些化合物对RAW264.7细胞的正常增殖具有较强的抑制作用，当降低化合物的浓度时，其对细胞的毒性降低，但是对炎症介质NO的抑制作用同时降低甚至消失，视为因细胞毒性引起的结果假阳性。其中，有14个化合物对炎症介质NO的释放均未表现出明显抑制活性。
根据前期实验结果优选出了两个具有显著抗炎活性的倍半萜内酯类化合物arnicolide B和arnicolide C，进行深入研究，进一步阐明对炎症信号通路的调控机制。ELISA法实验结果显示，arnicolide B和arnicolide C均可显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质PGE2和炎性因子IL-6、TNF-α。Western Blot实验结果表明，arnicolide B和arnicolide C均能显著下调LPS诱导的iNOS、COX-2蛋白高表达；arnicolide B和arnicolide C均不能显著抑制LPS诱导的NF-κB/IκB-α蛋白降解。在MAPK信号通路中，arnicolide B对ERK蛋白磷酸化无明显抑制作用，而arnicolide C则可以下调ERK磷酸化水平；但arnicolide B和arnicolide C对MAPK信号通路中的JNK和p38蛋白的磷酸化均表现出明显抑制作用。
综上所述，arnicolide B和arnicolide C对NF-κB通路均未表达出一定的抑制作用。而arnicolide B和arnicolide C都是通过阻断MAPK通路中蛋白磷酸化，来调控LPS诱导的炎性蛋白高表达，进而抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7产生和释放相关的炎症介质和炎症因子来发挥抗炎作用。
首先对前期从鹅不食草中分离鉴定得到的43个单体化合物进行了初步的体外抗炎活性评价，采用MTT法评价化合物细胞毒性的同时，通过Griess法检测化合物对小鼠巨噬细胞释放炎症介质NO的影响，根据结果优选出两个代表性活性化合物，并对这两个活性化合物进行深入研究。通过ELISA法来检测活性化合物对炎症介质前列腺素E2（PGE2）和炎症因子TNF-α以及IL-6过量释放的下调作用；使用Western Blot法来检测这两个化合物对炎性蛋白iNOS和COX-2的高表达和对NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解以及对MAPK通路中的ERK、JNK和p38蛋白磷酸化的调控作用。
在分离鉴定得到的43个单体化合物中，MTT实验结果显示，arnicolide B和arnicolide C分别在低于6.25μM和25μM浓度时对RAW264.7无明显的细胞毒性；Griess法实验结果表明，arnicolide B和arnicolide C对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质NO均具有显著的抑制作用。其中有些化合物在100μM时对炎症介质NO的释放有抑制活性，但进行MTT实验后，结果表明这些化合物对RAW264.7细胞的正常增殖具有较强的抑制作用，当降低化合物的浓度时，其对细胞的毒性降低，但是对炎症介质NO的抑制作用同时降低甚至消失，视为因细胞毒性引起的结果假阳性。其中，有14个化合物对炎症介质NO的释放均未表现出明显抑制活性。
根据前期实验结果优选出了两个具有显著抗炎活性的倍半萜内酯类化合物arnicolide B和arnicolide C，进行深入研究，进一步阐明对炎症信号通路的调控机制。ELISA法实验结果显示，arnicolide B和arnicolide C均可显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质PGE2和炎性因子IL-6、TNF-α。Western Blot实验结果表明，arnicolide B和arnicolide C均能显著下调LPS诱导的iNOS、COX-2蛋白高表达；arnicolide B和arnicolide C均不能显著抑制LPS诱导的NF-κB/IκB-α蛋白降解。在MAPK信号通路中，arnicolide B对ERK蛋白磷酸化无明显抑制作用，而arnicolide C则可以下调ERK磷酸化水平；但arnicolide B和arnicolide C对MAPK信号通路中的JNK和p38蛋白的磷酸化均表现出明显抑制作用。
综上所述，arnicolide B和arnicolide C对NF-κB通路均未表达出一定的抑制作用。而arnicolide B和arnicolide C都是通过阻断MAPK通路中蛋白磷酸化，来调控LPS诱导的炎性蛋白高表达，进而抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7产生和释放相关的炎症介质和炎症因子来发挥抗炎作用。