论文部分内容阅读
研究背景：急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)，是一种原始淋巴细胞或淋巴母细胞在骨髓内异常增殖的恶性克隆性疾病，在白血病治疗中最具挑战。ALL具有易复发、预后差等临床特点。ALL细胞基因组常发生染色体重排、碱基突变、剪接体异常表达等，影响淋巴细胞的成熟、增殖和耐药性等。探索ALL的基因组变异，为其临床危险分层和治疗提供指导。
PTKs和PTPs是ALL发病机制的重要参与者，主要通过介导黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、Ras、PI-3K、JAK-STAT等信号通路调控ALL细胞的活性和功能。PTPN21基因是NRPTPs的成员之一。PTPN21参与斑马鱼胚胎的器官发育与组织形成，参与维持小鼠HSCs在造血微环境中的稳态。膀胱癌、淋巴瘤等实体肿瘤中PTPN21处于高表达水平，其表达水平与肿瘤的恶性程度和分级相关。慢性淋巴细胞白血病和结肠癌中发现PTPN21的错义突变和移码-截断突变。本课题组前期研究中对Ph-B-ALL患者初诊和复发的白血病细胞进行全外显子测序，发现PTPN21基因单点突变c.1514C＞A(p.P505Q)与移植后复发相关。此外，PTPN21蛋白在ALL原代细胞表达量普遍偏高，外源性过表达PTPN21蛋白后ALL细胞株增殖和耐药水平增强。PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)是否改变ALL细胞的生物学活性；内源性PTPN21蛋白如何调控ALL的功能，不同类型PTPN21剪接体在ALL中是否功能不同；PTPN21蛋白是否调控ALL骨髓微环境均有待研究。
第一章PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)调控ALL细胞增殖的作用及机制研究
目的：研究PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)对ALL细胞生物学活性的调控作用，研究PTPN21基因点突变对ALL细胞增殖、周期、耐药、代谢的变化，探索作用机制。
方法：通过CRISPR-Cas9基因编辑方法构建NALM6和Raji细胞携带PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)的细胞株；通过CCK8法和甲基纤维素悬浮细胞集落形成单位(CFU)培养法检测ALL细胞的增殖能力；通过流式细胞术检测细胞周期；通过CCK8法和流式细胞术检测ALL细胞对柔红霉素的耐药性；通过透射电镜观察ALL细胞线粒体的数量和结构，通过基因组PCR检测ALL细胞线粒体基因拷贝数；通过转录组测序比较NALM6对照组和突变组的差异表达基因，探索增殖相关机制；通过WesternBlot检测MAPK通路、STAT信号分子的活化水平；通过免疫荧光检测NALM6对照组和突变组细胞src蛋白水平的表达差异。
结果：NALM6和Raji细胞携带PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)的细胞株构建成功；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)促进B-ALL细胞的增殖和周期进展，促进B-ALL细胞的耐药，增加B-ALL细胞的线粒体数量；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)通过活化src-MAPK信号通路在B-ALL发挥促增殖作用，src作为MAPK的上游分子，抑制src活化显著降低MAPK的活化水平；PTPN21基因点突c.1514C＞A(p.P505Q)通过调控周期相关蛋白CDK2、CDK4、P21和P53表达参与B-ALL的周期分布，中间作用分子尚需进一步研究。
结论：PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)促进NALM6细胞增殖、周期、耐药、代谢；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)通过促进下游src-MAPK、STAT信号通路的活化水平影响NALM6细胞的增殖水平和周期进展。
第二章PTPN21基因不同剪接体调控ALL细胞对NK细胞杀伤敏感性的作用及机制
目的：研究PTPN21长剪接体(CDSlong)和短剪接体(CDSshort)两种类型剪接体调控ALL细胞增殖的作用差异，研究PTPN21-CDSlong和CDSshort调控ALL细胞对NK细胞杀伤反应的作用差异，并探索作用机制。
方法：通过对转录组RT-PCR方法检测各白血病细胞株PTPN21剪接体的组成；通过转录组PolyA测序法进一步验证NALM6细胞株PTPN21基因剪接体的组成；通过荧光定量PCR检测各白血病细胞株PTPN21的表达；通过慢病毒转染途径分别构建NALM6-CDSlong和NALM6-CDSshort过表达细胞株，通过荧光定量PCR和WesternBlot方法鉴定过表达效果，通过CCK8法检测细胞的增殖能力，通过流式细胞术检测细胞周期；通过CRISPR-Cas9基因编辑方法构建NALM6细胞PTPN21-CDSlong敲除和PTPN21全部剪接体敲除细胞株；通过流式细胞术检测NK-92MI细胞对ALL细胞的杀伤率和脱颗粒水平；通过全转录组测序比较NALM6对照组和PTPN21-CDSlong敲除组细胞的差异表达基因，探索PTPN21调控ALL细胞对NK细胞杀伤逃逸的机制；通过流式细胞术检测ALL细胞表面NK相关配体的表达；通过荧光定量PCR检测ALL细胞抗原提呈相关伴侣分子的表达；通过ELISA检测ALL细胞TGF-β1和VEGFA的表达。
结果：NALM6细胞存在PTPN21基因两种类型剪接体：长剪接体(CDSlong)和短剪接体(CDSshort)；PTPN21-CDSlong和CDSshort两种剪接体具有相同的促进NALM6增殖的能力；构建成功NALM6PTPN21-CDSlong敲除和全剪接体敲除细胞株；PTPN21-CDSlong和CDSshort两种剪接体在调控NALM6对NK细胞的杀伤反应中具有相互拮抗作用，敲除NALM6细胞PTPN21-CDSlong可提高NALM6对NK的杀伤敏感性；PTPN21基因主要通过调控NALM6细胞表面HLA-I类分子的分布发挥对NK细胞杀伤敏感性的调节作用；PTPN21基因可能通过调控内源性抗原提呈相关的伴侣分子的表达影响HLA-I类分子的表达和分布。
结论：NALM6细胞株含有PTPN21基因CDSlong和CDSshort两种类型剪接体，两种剪接体具有相同的促进NALM6细胞增殖的能力；PTPN21基因通过调控抗原提呈相关伴侣分子影响NALM6细胞表面HLA-I类分子的表达从而参与调节ALL细胞对NK细胞的杀伤敏感性。
第三章PTPN21蛋白调控骨髓间充质干细胞生物学活性的研究
目的：研究PTPN21蛋白对BM-MSCs生物学活性及功能的影响，探索作用机制。方法：通过慢病毒转染的途径获得PTPN21基因过表达及敲降的BM-MSCs；通过荧光定量PCR和WesternBlot验证PTPN21基因过表达及敲降效果；通过流式细胞术检测BM-MSCs细胞表面标记、凋亡、周期、免疫抑制能力；通过CCK8法检测BM-MSCs的增殖；通过WesternBlot检测增殖和周期相关蛋白的表达情况；通过荧光定量PCR法检测BM-MSCs干性基因、成骨及成脂分化相关基因、衰老相关基因、RNA-seq差异表达基因的表达水平；分别通过茜素红染色和油红O染色检测BM-MSCs的成骨和成脂分化能力；通过β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测BM-MSCs的衰老情况；通过全转录组测序筛选差异表达基因，探索PTPN21调控BM-MSCs的机制；通过Transwell实验检测BM-MSCs及MCF7、ECs的迁移能力。
结果：BM-MSCs过表达PTPN21蛋白后生物学活性变化：增殖能力受损、细胞周期阻滞到G0期、细胞衰老水平升高；细胞迁移和凋亡不受影响。BM-MSCs过表达PTPN21蛋白后对作用的靶细胞影响：免疫抑制能力减弱；趋化因子合成增多，促进肿瘤细胞和血管内皮细胞的趋化迁移；PTPN21蛋白是否通过调控BM-MSCs功能影响白血病的发病和治疗尚无证据，下一步将围绕这一问题继续研究。
结论：BM-MSCsPTPN21蛋白的表达水平与其细胞活性和功能相关；高表达PTPN21的BM-MSCs细胞活性降低和免疫功能缺陷，肿瘤细胞和血管内皮细胞的趋化迁移能力增强。
PTKs和PTPs是ALL发病机制的重要参与者，主要通过介导黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、Ras、PI-3K、JAK-STAT等信号通路调控ALL细胞的活性和功能。PTPN21基因是NRPTPs的成员之一。PTPN21参与斑马鱼胚胎的器官发育与组织形成，参与维持小鼠HSCs在造血微环境中的稳态。膀胱癌、淋巴瘤等实体肿瘤中PTPN21处于高表达水平，其表达水平与肿瘤的恶性程度和分级相关。慢性淋巴细胞白血病和结肠癌中发现PTPN21的错义突变和移码-截断突变。本课题组前期研究中对Ph-B-ALL患者初诊和复发的白血病细胞进行全外显子测序，发现PTPN21基因单点突变c.1514C＞A(p.P505Q)与移植后复发相关。此外，PTPN21蛋白在ALL原代细胞表达量普遍偏高，外源性过表达PTPN21蛋白后ALL细胞株增殖和耐药水平增强。PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)是否改变ALL细胞的生物学活性；内源性PTPN21蛋白如何调控ALL的功能，不同类型PTPN21剪接体在ALL中是否功能不同；PTPN21蛋白是否调控ALL骨髓微环境均有待研究。
第一章PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)调控ALL细胞增殖的作用及机制研究
目的：研究PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)对ALL细胞生物学活性的调控作用，研究PTPN21基因点突变对ALL细胞增殖、周期、耐药、代谢的变化，探索作用机制。
方法：通过CRISPR-Cas9基因编辑方法构建NALM6和Raji细胞携带PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)的细胞株；通过CCK8法和甲基纤维素悬浮细胞集落形成单位(CFU)培养法检测ALL细胞的增殖能力；通过流式细胞术检测细胞周期；通过CCK8法和流式细胞术检测ALL细胞对柔红霉素的耐药性；通过透射电镜观察ALL细胞线粒体的数量和结构，通过基因组PCR检测ALL细胞线粒体基因拷贝数；通过转录组测序比较NALM6对照组和突变组的差异表达基因，探索增殖相关机制；通过WesternBlot检测MAPK通路、STAT信号分子的活化水平；通过免疫荧光检测NALM6对照组和突变组细胞src蛋白水平的表达差异。
结果：NALM6和Raji细胞携带PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)的细胞株构建成功；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)促进B-ALL细胞的增殖和周期进展，促进B-ALL细胞的耐药，增加B-ALL细胞的线粒体数量；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)通过活化src-MAPK信号通路在B-ALL发挥促增殖作用，src作为MAPK的上游分子，抑制src活化显著降低MAPK的活化水平；PTPN21基因点突c.1514C＞A(p.P505Q)通过调控周期相关蛋白CDK2、CDK4、P21和P53表达参与B-ALL的周期分布，中间作用分子尚需进一步研究。
结论：PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)促进NALM6细胞增殖、周期、耐药、代谢；PTPN21基因点突变c.1514C＞A(p.P505Q)通过促进下游src-MAPK、STAT信号通路的活化水平影响NALM6细胞的增殖水平和周期进展。
第二章PTPN21基因不同剪接体调控ALL细胞对NK细胞杀伤敏感性的作用及机制
目的：研究PTPN21长剪接体(CDSlong)和短剪接体(CDSshort)两种类型剪接体调控ALL细胞增殖的作用差异，研究PTPN21-CDSlong和CDSshort调控ALL细胞对NK细胞杀伤反应的作用差异，并探索作用机制。
方法：通过对转录组RT-PCR方法检测各白血病细胞株PTPN21剪接体的组成；通过转录组PolyA测序法进一步验证NALM6细胞株PTPN21基因剪接体的组成；通过荧光定量PCR检测各白血病细胞株PTPN21的表达；通过慢病毒转染途径分别构建NALM6-CDSlong和NALM6-CDSshort过表达细胞株，通过荧光定量PCR和WesternBlot方法鉴定过表达效果，通过CCK8法检测细胞的增殖能力，通过流式细胞术检测细胞周期；通过CRISPR-Cas9基因编辑方法构建NALM6细胞PTPN21-CDSlong敲除和PTPN21全部剪接体敲除细胞株；通过流式细胞术检测NK-92MI细胞对ALL细胞的杀伤率和脱颗粒水平；通过全转录组测序比较NALM6对照组和PTPN21-CDSlong敲除组细胞的差异表达基因，探索PTPN21调控ALL细胞对NK细胞杀伤逃逸的机制；通过流式细胞术检测ALL细胞表面NK相关配体的表达；通过荧光定量PCR检测ALL细胞抗原提呈相关伴侣分子的表达；通过ELISA检测ALL细胞TGF-β1和VEGFA的表达。
结果：NALM6细胞存在PTPN21基因两种类型剪接体：长剪接体(CDSlong)和短剪接体(CDSshort)；PTPN21-CDSlong和CDSshort两种剪接体具有相同的促进NALM6增殖的能力；构建成功NALM6PTPN21-CDSlong敲除和全剪接体敲除细胞株；PTPN21-CDSlong和CDSshort两种剪接体在调控NALM6对NK细胞的杀伤反应中具有相互拮抗作用，敲除NALM6细胞PTPN21-CDSlong可提高NALM6对NK的杀伤敏感性；PTPN21基因主要通过调控NALM6细胞表面HLA-I类分子的分布发挥对NK细胞杀伤敏感性的调节作用；PTPN21基因可能通过调控内源性抗原提呈相关的伴侣分子的表达影响HLA-I类分子的表达和分布。
结论：NALM6细胞株含有PTPN21基因CDSlong和CDSshort两种类型剪接体，两种剪接体具有相同的促进NALM6细胞增殖的能力；PTPN21基因通过调控抗原提呈相关伴侣分子影响NALM6细胞表面HLA-I类分子的表达从而参与调节ALL细胞对NK细胞的杀伤敏感性。
第三章PTPN21蛋白调控骨髓间充质干细胞生物学活性的研究
目的：研究PTPN21蛋白对BM-MSCs生物学活性及功能的影响，探索作用机制。方法：通过慢病毒转染的途径获得PTPN21基因过表达及敲降的BM-MSCs；通过荧光定量PCR和WesternBlot验证PTPN21基因过表达及敲降效果；通过流式细胞术检测BM-MSCs细胞表面标记、凋亡、周期、免疫抑制能力；通过CCK8法检测BM-MSCs的增殖；通过WesternBlot检测增殖和周期相关蛋白的表达情况；通过荧光定量PCR法检测BM-MSCs干性基因、成骨及成脂分化相关基因、衰老相关基因、RNA-seq差异表达基因的表达水平；分别通过茜素红染色和油红O染色检测BM-MSCs的成骨和成脂分化能力；通过β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测BM-MSCs的衰老情况；通过全转录组测序筛选差异表达基因，探索PTPN21调控BM-MSCs的机制；通过Transwell实验检测BM-MSCs及MCF7、ECs的迁移能力。
结果：BM-MSCs过表达PTPN21蛋白后生物学活性变化：增殖能力受损、细胞周期阻滞到G0期、细胞衰老水平升高；细胞迁移和凋亡不受影响。BM-MSCs过表达PTPN21蛋白后对作用的靶细胞影响：免疫抑制能力减弱；趋化因子合成增多，促进肿瘤细胞和血管内皮细胞的趋化迁移；PTPN21蛋白是否通过调控BM-MSCs功能影响白血病的发病和治疗尚无证据，下一步将围绕这一问题继续研究。
结论：BM-MSCsPTPN21蛋白的表达水平与其细胞活性和功能相关；高表达PTPN21的BM-MSCs细胞活性降低和免疫功能缺陷，肿瘤细胞和血管内皮细胞的趋化迁移能力增强。