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第一部分贝沙罗汀对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用研究
目的：观察贝沙罗汀(Bexarotene)对小鼠脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion, CIR)损伤的神经保护作用，探讨Bexarotene对c-JunN端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)介导的凋亡信号通路的影响。
方法:
1.90只8-12周龄，体重20-25g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为假手术(Sham)组，溶剂处理(Vehicle)组，药物(Bexarotene)组，每组30只。Vehicle组和Bexarotene组小鼠采用中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion，t-MCAO)方法构建CIR损伤模型。Sham组小鼠除不插入线栓外，其余操作均相同。Bexarotene组小鼠术后立即及每天按实验预设的时间点以5mg/kg的剂量腹腔注射给与Bexarotene。Vehicle组小鼠给予等量的溶剂(除不含药物外，其余成分均相同)，Sham组小鼠不给予Bexarotene或溶剂干预。
2.主要观察指标：通过神经功能缺失程度评分(Modified Neurological Severity Score：mNSS)、转棒实验以及Morris水迷宫实验观察Bexarotene对t-MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2，3，5—氯化三苯基四氮唑染色、核磁共振成像检测小鼠脑梗死体积，苏木精-伊红染色观察小鼠海马区域神经细胞病理结构变化，免疫荧光染色检测小鼠损伤侧脑组织皮层中活化凋亡蛋白酶3(Cleaved Caspase 3)蛋白表达，TUNEL染色检测小鼠损伤侧脑组织皮层神经细胞凋亡水平。Westernblot检测丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路蛋白JNK、P-JNK、P-C-Jun以及凋亡执行蛋白Caspase3、CleavedCaspase3表达水平。
结果：
1.与Vehicle组小鼠相比，t-MCAO后3天、7天、14天，Bexarotene组小鼠mNSS评分显著降低(P<0.05)。Bexarotene组小鼠转棒停留时间较Vehicle组小鼠延长，但不具有统计学差异(P>0.05)。在t-MCAO后17-19天，与Vehicle组小鼠相比，Bexarotene组小鼠巡台时间明显缩短(P<0.05)。在t-MCAO后20天，Bexarotene组小鼠较Vehicle组小鼠穿梭平台次数明显增加(P<0.05)。
2.与Vehicle组相比，给与5mg/kg/d的Bexarotene干预可明显降低小鼠脑梗死体积(P<0.05)，减轻海马CA1区神经细胞损伤评级(P<0.05)，减少脑梗死侧皮层神经细胞凋亡数量(P<0.05)，并抑制该部位凋亡执行关键蛋白CleavedCaspase3表达(P<0.05)。
3.在t-MCAO后第3天和第5天，与Vehicle组相比，Bexarotene小鼠组P-JNK、P-C-Jun，CleavedCaspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。
结论：Bexarotene干预可显著降低小鼠CIR损伤后脑梗死体积，减轻伤灶组织损伤及神经细胞凋亡，促进CIR后小鼠神经功能恢复，其保护作用可能与抑制JNK/Caspase3信号通路的激活有关。
第二部分基于iTRAQ定量蛋白质组学技术分析贝沙罗汀对小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制研究
目的:基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)蛋白质组学及生物信息学技术，检测分析Bexarotene对t-MCAO模型小鼠脑组织损伤部位差异蛋白表达的影响，为进一步寻找Bexarotene对CIR损伤保护作用的靶点及机制提供新思路。
方法:
1.9只8-12周龄，体重20-25g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为Sham组，Vehicle组，Bexarotene组，每组各3只。Vehicle、Bexarotene组小鼠通过t-MCAO方法构建CIR损伤模型，Sham组小鼠除不插入线栓外，其余操作均相同。Bexarotene组小鼠术后立即及每天腹腔注射给予5mg/kg的药物，Vehicle组小鼠则给予等量的溶剂，Sham组不给予Bexarotene或溶剂干预。连续给药3天后，生理盐水灌注取脑，获取检测标本。
2.运用iTRAQ联合LC/MS技术获得Bexarotene干预小鼠t-MCAO模型后的蛋白质谱数据，采用Proteinpilot软件筛选蛋白质谱数据中各组间差异表达的蛋白质。通过基因本体(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析等生物信息学方法，对Vehicle与Bexarotene两组间差异蛋白质进行分析，揭示其参与的生物功能及信号转导通路。
结果：
1.在Sham组、Vehicle组及Bexarotene组小鼠中定量检测出4454种蛋白质，生物信息学分析结果显示鉴定出的蛋白质在脑组织细胞中分布广泛，功能多样，参与多种生物学过程。
2.t-MCAO模型小鼠使用Bexarotene干预后损伤侧脑组织中共检测出149种差异蛋白质，其中138种上调蛋白，11种下调蛋白。GO富集分析结果表明，这些差异蛋白主要位于细胞囊泡，髓鞘，细胞质等处，参与突触传递，能量代谢，细胞分泌等生物学过程。KEGG信号通路分析结果显示，149种差异蛋白主要参与能量代谢，钙信号及MAPK等信号通路。其中MAPK信号通路中上调的主要蛋白为热休克蛋白70(heat shock protein 70 Kda, HSP70)，下调的蛋白主要为JNK相互作用蛋白3(JNK-interacting protein, JIP3)。
结论:Bexarotene干预CIR损伤小鼠后脑组织蛋白质存在明显差异性表达，为进一步探索、筛选Bexarotene作用于CIR治疗新靶点提供重要参考。
第三部分贝沙罗汀对HT22细胞氧糖剥夺/复氧损伤后的作用及其对JIP3蛋白表达的影响
目的：第二部分研究结果表明，Bexarotene干预显著下调JIP3蛋白水平，而对JIP1蛋白水平无显著性影响。本部分旨在观察Bexarotene在氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型中对小鼠海马神经元细胞株(hippocampal neuronal cell line, HT22)的作用，并进一步探讨Bexarotene对JIP3蛋白水平的影响。
方法：
1.qRT-PCR检测氧糖剥夺2h，复氧0h，12h，24h，36h后HT22细胞JIP3，JIP1基因表达水平，并用Westernblot验证。选取差异表达最明显的时间点，用于后续研究。
2.Bexarotene干预对OGD/R后HT22细胞损伤、凋亡水平和JIP3/JNK信号通路的影响观察。
(1)实验分组：HT22细胞氧糖剥夺2h后，复氧12h构建OGD/R模型。细胞随机分为空白对照组(Control)，阴性对照组(Control+Bexarotene)，模型组(OGD/R)，Bexarotene干预组(OGD/R+Bexarotene)。
(2)主要观察指标：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(thiazolyl blue tetrazolium bromide ，MTT)法检测HT22细胞存活率，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出率测定HT22细胞死亡率；流式细胞技术检测HT22细胞凋亡率；光学显微镜直接观察HT22细胞数目和形态变化；Westernblot测定细胞JIP3、细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1, ASK1)、p-ASK1、p-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平。
3.Bexarotene是否通过影响JIP3的表达调节JNK/Caspase3信号通路的激活
(1)构建JIP3过表达质粒，转染HT22细胞后，通过qRT-PCR、Westernblot验证JIP3在基因及蛋白层面的过表达水平。
(2)将HT22细胞分为Control组、Control+空载病毒组(NC-JIP3)、OGD/R组、OGD/R+NC-JIP3组、OGD/R+JIP3过表达组(OE-JIP3)，OGD/R+Bexarotene组，OGD/R+OE-JIP3+Bexarotene组。采用Westernblot观察HT22细胞JIP3、p-ASK1、p-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平。
结果：
1.OGD后复氧0h、12h后JIP3的蛋白表达量较Control组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.5)。OGD后复氧36h内JIP1蛋白水平较Control组变化不明显(P>0.5)。OGD后复氧12h时JIP3蛋白水平表达最高，故选取此时间点应用于后续研究。
2.Bexarotene干预对OGD/R后HT22细胞损伤、凋亡水平和JIP3/ASK1/JNK信号通路的影响观察。
(1)与Control组相比，OGD/R组HT22细胞的MTT值明显降低(P<0.05)，而LDH漏出率明显升高(P<0.05)；与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞的MTT值显著升高(P<0.05)，而LDH漏出率显著降低(P<0.05)。
(2)流式细胞技术检测结果表明，与Control组相比，OGD/R组HT22细胞的凋亡率明显增加(P<0.05)；与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞的凋亡率显著下降(P<0.05)。
(3)光镜下观察HT22细胞形态和数目，结果显示：与Control组相比，OGD/R组HT22细胞数量明显减少，细胞形态皱缩明显，细胞间网络连接断裂。与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞数量增加，细胞皱缩、网络断裂状态明显缓解。
(4)与Control组相比，OGD/R组HT22细胞JIP3,P-ASK1,P-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平显著增加(P<0.05)。与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞JIP3，P-ASK1，P-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平显著减少(P<0.05)。
3.Bexarotene通过降低JIP3表达，抑制JNK/Caspase3信号通路的激活。
(1)JIP3过表达质粒转染HT22细胞后，OE-JIP3组JIP3的mRNA、蛋白水平均明显高于NC-JIP3组(P<0.05)。
(2)空载质粒对Control组细胞和OGD/R组细胞蛋白水平无显著性影响。与Control组相比，OGD/R组HT22细胞JIP3,P-ASK1,P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平均明显升高(P<0.05)。与OGD/R组相比，OGD/R+OE-JIP3组HT22细胞JIP3，P-ASK1，P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与OGD/R+OE-JIP3组相比，OGD/R+OE-JIP3组HT22细胞在使用Bexarotene干预后，JIP3,P-ASK1,P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平均明显下降(P<0.05)。
结论:Bexarotene可通过降低JIP3蛋白水平，抑制JIP3/ASK1/JNK/Caspase3信号通路激活，减轻HT22细胞OGD/R损伤。
目的：观察贝沙罗汀(Bexarotene)对小鼠脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion, CIR)损伤的神经保护作用，探讨Bexarotene对c-JunN端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)介导的凋亡信号通路的影响。
方法:
1.90只8-12周龄，体重20-25g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为假手术(Sham)组，溶剂处理(Vehicle)组，药物(Bexarotene)组，每组30只。Vehicle组和Bexarotene组小鼠采用中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion，t-MCAO)方法构建CIR损伤模型。Sham组小鼠除不插入线栓外，其余操作均相同。Bexarotene组小鼠术后立即及每天按实验预设的时间点以5mg/kg的剂量腹腔注射给与Bexarotene。Vehicle组小鼠给予等量的溶剂(除不含药物外，其余成分均相同)，Sham组小鼠不给予Bexarotene或溶剂干预。
2.主要观察指标：通过神经功能缺失程度评分(Modified Neurological Severity Score：mNSS)、转棒实验以及Morris水迷宫实验观察Bexarotene对t-MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2，3，5—氯化三苯基四氮唑染色、核磁共振成像检测小鼠脑梗死体积，苏木精-伊红染色观察小鼠海马区域神经细胞病理结构变化，免疫荧光染色检测小鼠损伤侧脑组织皮层中活化凋亡蛋白酶3(Cleaved Caspase 3)蛋白表达，TUNEL染色检测小鼠损伤侧脑组织皮层神经细胞凋亡水平。Westernblot检测丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路蛋白JNK、P-JNK、P-C-Jun以及凋亡执行蛋白Caspase3、CleavedCaspase3表达水平。
结果：
1.与Vehicle组小鼠相比，t-MCAO后3天、7天、14天，Bexarotene组小鼠mNSS评分显著降低(P<0.05)。Bexarotene组小鼠转棒停留时间较Vehicle组小鼠延长，但不具有统计学差异(P>0.05)。在t-MCAO后17-19天，与Vehicle组小鼠相比，Bexarotene组小鼠巡台时间明显缩短(P<0.05)。在t-MCAO后20天，Bexarotene组小鼠较Vehicle组小鼠穿梭平台次数明显增加(P<0.05)。
2.与Vehicle组相比，给与5mg/kg/d的Bexarotene干预可明显降低小鼠脑梗死体积(P<0.05)，减轻海马CA1区神经细胞损伤评级(P<0.05)，减少脑梗死侧皮层神经细胞凋亡数量(P<0.05)，并抑制该部位凋亡执行关键蛋白CleavedCaspase3表达(P<0.05)。
3.在t-MCAO后第3天和第5天，与Vehicle组相比，Bexarotene小鼠组P-JNK、P-C-Jun，CleavedCaspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。
结论：Bexarotene干预可显著降低小鼠CIR损伤后脑梗死体积，减轻伤灶组织损伤及神经细胞凋亡，促进CIR后小鼠神经功能恢复，其保护作用可能与抑制JNK/Caspase3信号通路的激活有关。
第二部分基于iTRAQ定量蛋白质组学技术分析贝沙罗汀对小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制研究
目的:基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)蛋白质组学及生物信息学技术，检测分析Bexarotene对t-MCAO模型小鼠脑组织损伤部位差异蛋白表达的影响，为进一步寻找Bexarotene对CIR损伤保护作用的靶点及机制提供新思路。
方法:
1.9只8-12周龄，体重20-25g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为Sham组，Vehicle组，Bexarotene组，每组各3只。Vehicle、Bexarotene组小鼠通过t-MCAO方法构建CIR损伤模型，Sham组小鼠除不插入线栓外，其余操作均相同。Bexarotene组小鼠术后立即及每天腹腔注射给予5mg/kg的药物，Vehicle组小鼠则给予等量的溶剂，Sham组不给予Bexarotene或溶剂干预。连续给药3天后，生理盐水灌注取脑，获取检测标本。
2.运用iTRAQ联合LC/MS技术获得Bexarotene干预小鼠t-MCAO模型后的蛋白质谱数据，采用Proteinpilot软件筛选蛋白质谱数据中各组间差异表达的蛋白质。通过基因本体(Gene Ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析等生物信息学方法，对Vehicle与Bexarotene两组间差异蛋白质进行分析，揭示其参与的生物功能及信号转导通路。
结果：
1.在Sham组、Vehicle组及Bexarotene组小鼠中定量检测出4454种蛋白质，生物信息学分析结果显示鉴定出的蛋白质在脑组织细胞中分布广泛，功能多样，参与多种生物学过程。
2.t-MCAO模型小鼠使用Bexarotene干预后损伤侧脑组织中共检测出149种差异蛋白质，其中138种上调蛋白，11种下调蛋白。GO富集分析结果表明，这些差异蛋白主要位于细胞囊泡，髓鞘，细胞质等处，参与突触传递，能量代谢，细胞分泌等生物学过程。KEGG信号通路分析结果显示，149种差异蛋白主要参与能量代谢，钙信号及MAPK等信号通路。其中MAPK信号通路中上调的主要蛋白为热休克蛋白70(heat shock protein 70 Kda, HSP70)，下调的蛋白主要为JNK相互作用蛋白3(JNK-interacting protein, JIP3)。
结论:Bexarotene干预CIR损伤小鼠后脑组织蛋白质存在明显差异性表达，为进一步探索、筛选Bexarotene作用于CIR治疗新靶点提供重要参考。
第三部分贝沙罗汀对HT22细胞氧糖剥夺/复氧损伤后的作用及其对JIP3蛋白表达的影响
目的：第二部分研究结果表明，Bexarotene干预显著下调JIP3蛋白水平，而对JIP1蛋白水平无显著性影响。本部分旨在观察Bexarotene在氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型中对小鼠海马神经元细胞株(hippocampal neuronal cell line, HT22)的作用，并进一步探讨Bexarotene对JIP3蛋白水平的影响。
方法：
1.qRT-PCR检测氧糖剥夺2h，复氧0h，12h，24h，36h后HT22细胞JIP3，JIP1基因表达水平，并用Westernblot验证。选取差异表达最明显的时间点，用于后续研究。
2.Bexarotene干预对OGD/R后HT22细胞损伤、凋亡水平和JIP3/JNK信号通路的影响观察。
(1)实验分组：HT22细胞氧糖剥夺2h后，复氧12h构建OGD/R模型。细胞随机分为空白对照组(Control)，阴性对照组(Control+Bexarotene)，模型组(OGD/R)，Bexarotene干预组(OGD/R+Bexarotene)。
(2)主要观察指标：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(thiazolyl blue tetrazolium bromide ，MTT)法检测HT22细胞存活率，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出率测定HT22细胞死亡率；流式细胞技术检测HT22细胞凋亡率；光学显微镜直接观察HT22细胞数目和形态变化；Westernblot测定细胞JIP3、细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1, ASK1)、p-ASK1、p-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平。
3.Bexarotene是否通过影响JIP3的表达调节JNK/Caspase3信号通路的激活
(1)构建JIP3过表达质粒，转染HT22细胞后，通过qRT-PCR、Westernblot验证JIP3在基因及蛋白层面的过表达水平。
(2)将HT22细胞分为Control组、Control+空载病毒组(NC-JIP3)、OGD/R组、OGD/R+NC-JIP3组、OGD/R+JIP3过表达组(OE-JIP3)，OGD/R+Bexarotene组，OGD/R+OE-JIP3+Bexarotene组。采用Westernblot观察HT22细胞JIP3、p-ASK1、p-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平。
结果：
1.OGD后复氧0h、12h后JIP3的蛋白表达量较Control组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.5)。OGD后复氧36h内JIP1蛋白水平较Control组变化不明显(P>0.5)。OGD后复氧12h时JIP3蛋白水平表达最高，故选取此时间点应用于后续研究。
2.Bexarotene干预对OGD/R后HT22细胞损伤、凋亡水平和JIP3/ASK1/JNK信号通路的影响观察。
(1)与Control组相比，OGD/R组HT22细胞的MTT值明显降低(P<0.05)，而LDH漏出率明显升高(P<0.05)；与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞的MTT值显著升高(P<0.05)，而LDH漏出率显著降低(P<0.05)。
(2)流式细胞技术检测结果表明，与Control组相比，OGD/R组HT22细胞的凋亡率明显增加(P<0.05)；与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞的凋亡率显著下降(P<0.05)。
(3)光镜下观察HT22细胞形态和数目，结果显示：与Control组相比，OGD/R组HT22细胞数量明显减少，细胞形态皱缩明显，细胞间网络连接断裂。与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞数量增加，细胞皱缩、网络断裂状态明显缓解。
(4)与Control组相比，OGD/R组HT22细胞JIP3,P-ASK1,P-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平显著增加(P<0.05)。与OGD/R组相比，Bexarotene组HT22细胞JIP3，P-ASK1，P-JNK及CleavedCaspase3蛋白水平显著减少(P<0.05)。
3.Bexarotene通过降低JIP3表达，抑制JNK/Caspase3信号通路的激活。
(1)JIP3过表达质粒转染HT22细胞后，OE-JIP3组JIP3的mRNA、蛋白水平均明显高于NC-JIP3组(P<0.05)。
(2)空载质粒对Control组细胞和OGD/R组细胞蛋白水平无显著性影响。与Control组相比，OGD/R组HT22细胞JIP3,P-ASK1,P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平均明显升高(P<0.05)。与OGD/R组相比，OGD/R+OE-JIP3组HT22细胞JIP3，P-ASK1，P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与OGD/R+OE-JIP3组相比，OGD/R+OE-JIP3组HT22细胞在使用Bexarotene干预后，JIP3,P-ASK1,P-JNK和CleavedCaspase3蛋白水平均明显下降(P<0.05)。
结论:Bexarotene可通过降低JIP3蛋白水平，抑制JIP3/ASK1/JNK/Caspase3信号通路激活，减轻HT22细胞OGD/R损伤。