论文部分内容阅读
目的
本课题旨在探讨β-石竹烯(β-caryophyllene，BCP)是否通过作用于小胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，改善脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIR)神经炎症反应，从而发挥脑保护作用。
方法
1.雄性野生型C57BL/6小鼠随机分为假手术组(sham)，溶剂组(vehcile)组及BCP干预组。采用大脑右侧中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)构建CIR模型。BCP组小鼠采分别于缺血前3d和缺血后2h经腹腔注射给予8mg/kg、24mg/kg及72mg/kg剂量的BCP。溶剂组和BCP组行MCAO模型制备，sham组只分离动脉，不插拴。缺血1h，再灌注24h后进行神经行为学缺损评分、TTC染色测定脑梗死体积、干湿重法测定脑含水量、TUNEL法检测缺血侧皮层及海马CA1区细胞凋亡情况，从而验证BCP的神经保护作用。通过免疫荧光染色(immunofluorescence, IF)及免疫印迹法(western bolt)检测小胶质细胞活化情况、磁珠分选法分离缺血侧小胶质细胞，ELISA法检测小胶质细胞来源的炎症因子的释放，westernblot检测BCP对小胶质细胞活化和极化的作用等，探讨BCP对神经炎症反应的影响。
2.将雄性C57BL/6小鼠随机分组为sham、溶剂组(vehicle组)、BCP组。采用MCAO法建立CIR模型，BCP组小鼠采分别于缺血前3d和缺血后2h经腹腔注射给予8mg/kg、24mg/kg及72mg/kg剂量的BCP。Vehicle组和BCP组行MCAO模型制备，sham组只分离动脉，不插拴。首先，采用westernblot法检测小鼠缺血1h，再灌注不同时间点后Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)及髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白水平的动态变化情况。其次，通过westernbolt法检测不同剂量BCP对TLR4及MyD88蛋白水平的影响，IF法检测BCP对Iba1+TLR4+及Iba1+MyD88+小胶质细胞数量的影响；然后，通过westernbolt法检测BCP对MCAO后6h、24h及72h后TLR4及MyD88蛋白水平的影响；最后，通过分离细胞浆/细胞核蛋白检测BCP对NF-κB通路蛋白的作用。
3.体外培养原代小胶质细胞，用BCP进行干预处理。采用WST-1检测BCP对原代小胶质细胞活性的影响，筛选BCP最佳干预浓度。脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS)加干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)刺激建立体外炎症模型。随机分为control组，LPS+IFN-γ组及BCP预处理组。BCP作用24h后，加入LPS+IFN-γ继续作用48h，采用Griess法检测一氧化氮(nitric oxide，NO)的释放。westernblot检测诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, INOS)蛋白水平。ELISA法测定炎性因子的释放。IF及westernblot检测小胶质细胞极化及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白水平变化情况。将LPS+IFN-γ和BCP+LPS+IFN-γ处理的原代小胶质细胞的条件培养基作用于原代神经元，流式细胞技术检测原代神经元凋亡情况。
结果
1.首先，BCP可显著改善MCAO后24h及72h小鼠的神经功能缺损。MCAO后24h，BCP降低MCAO小鼠脑梗死体积，改善脑水肿情况，减少脑缺血侧神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。其次，BCP可显著抑制脑缺血侧小胶质细胞活化，减少小胶质细胞来源的肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfator-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)的释放。最后，BCP抑制MCAO小鼠小胶质细胞M1型极化，促进M2型极化，从而改善MCAO小鼠神经炎症反应。
2.小鼠MCAO后6h，TLR4及MyD88蛋白水平均较sham组显著升高，MCAO后24h达到高峰，持续到MCAO后72h开始降低。MCAO后24h，BCP可剂量依赖性的降低TLR4、MyD88蛋白水平，减少缺血侧皮层Iba1+TLR4+及Iba1+MyD88+小胶质细胞数。与溶剂组比较，MCAO后6h及24h，BCP显著降低TLR4、MyD88蛋白水平；MCAO后72h，BCP下调TLR4蛋白水平，对MyD88蛋白水平无显著性影响。MCAO后24h，在sham组中BCP对磷酸化IκB-α(phosphorylatedIκB-α,p-IκB-α)，IκB-α及细胞核中磷酸化NF-κBP65(phosphorylated P65, p-P65)蛋白水平无显著性影响。与溶剂组相比，BCP显著降低p-IκB-α及p-P65蛋白水平，增加NF-κBP65抑制蛋白IκB-α蛋白水平。
3.BCP(0-50μM)各浓度均对原代小胶质细胞活性无显著性影响。该结果表明，BCP细胞毒性较低，安全性好。BCP可抑制LPS+IFN-γ激活的原小胶质细胞释放NO、TNF-α、IL-1β及IL-6，降低INOS蛋白水平，并可抑制原代小胶质细胞M1型极化，促进其M2型极化。BCP浓度依赖的降低LPS+IFN-γ刺激后原代小胶质细胞TLR4、MyD88蛋白水平的增加，同时降低活化原代小胶质细胞TLR4及MyD88免疫荧光强度。LPS+IFN-γ刺激后原代小胶质细胞内p-IκB-α、核内p-P65蛋白水平显著增加，IκB-α的蛋白水平显著下降，而BCP预处理改善p-IκB-α及核中p-P65蛋白水平的上调程度，恢复IκB-α蛋白水平。与LPS+IFN-γ单独处理的原代小胶质细胞培养基相比，BCP处理后的原代小胶质细胞条件培养基可减少原代神经元凋亡。
结论
1.BCP可能通过抑制MCAO后脑缺血侧神经细胞凋亡，小胶质细胞介导的神经炎症反应等改善MCAO小鼠神经功能缺损；
2.BCP可能通过对小胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的有力调控，抑制MCAO后小胶质细胞过度活化和M1型极化，促进M2型极化，从而减轻MCAO后神经炎症反应，进而减轻对神经元的损伤。
本课题旨在探讨β-石竹烯(β-caryophyllene，BCP)是否通过作用于小胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，改善脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIR)神经炎症反应，从而发挥脑保护作用。
方法
1.雄性野生型C57BL/6小鼠随机分为假手术组(sham)，溶剂组(vehcile)组及BCP干预组。采用大脑右侧中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)构建CIR模型。BCP组小鼠采分别于缺血前3d和缺血后2h经腹腔注射给予8mg/kg、24mg/kg及72mg/kg剂量的BCP。溶剂组和BCP组行MCAO模型制备，sham组只分离动脉，不插拴。缺血1h，再灌注24h后进行神经行为学缺损评分、TTC染色测定脑梗死体积、干湿重法测定脑含水量、TUNEL法检测缺血侧皮层及海马CA1区细胞凋亡情况，从而验证BCP的神经保护作用。通过免疫荧光染色(immunofluorescence, IF)及免疫印迹法(western bolt)检测小胶质细胞活化情况、磁珠分选法分离缺血侧小胶质细胞，ELISA法检测小胶质细胞来源的炎症因子的释放，westernblot检测BCP对小胶质细胞活化和极化的作用等，探讨BCP对神经炎症反应的影响。
2.将雄性C57BL/6小鼠随机分组为sham、溶剂组(vehicle组)、BCP组。采用MCAO法建立CIR模型，BCP组小鼠采分别于缺血前3d和缺血后2h经腹腔注射给予8mg/kg、24mg/kg及72mg/kg剂量的BCP。Vehicle组和BCP组行MCAO模型制备，sham组只分离动脉，不插拴。首先，采用westernblot法检测小鼠缺血1h，再灌注不同时间点后Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)及髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白水平的动态变化情况。其次，通过westernbolt法检测不同剂量BCP对TLR4及MyD88蛋白水平的影响，IF法检测BCP对Iba1+TLR4+及Iba1+MyD88+小胶质细胞数量的影响；然后，通过westernbolt法检测BCP对MCAO后6h、24h及72h后TLR4及MyD88蛋白水平的影响；最后，通过分离细胞浆/细胞核蛋白检测BCP对NF-κB通路蛋白的作用。
3.体外培养原代小胶质细胞，用BCP进行干预处理。采用WST-1检测BCP对原代小胶质细胞活性的影响，筛选BCP最佳干预浓度。脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS)加干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)刺激建立体外炎症模型。随机分为control组，LPS+IFN-γ组及BCP预处理组。BCP作用24h后，加入LPS+IFN-γ继续作用48h，采用Griess法检测一氧化氮(nitric oxide，NO)的释放。westernblot检测诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, INOS)蛋白水平。ELISA法测定炎性因子的释放。IF及westernblot检测小胶质细胞极化及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白水平变化情况。将LPS+IFN-γ和BCP+LPS+IFN-γ处理的原代小胶质细胞的条件培养基作用于原代神经元，流式细胞技术检测原代神经元凋亡情况。
结果
1.首先，BCP可显著改善MCAO后24h及72h小鼠的神经功能缺损。MCAO后24h，BCP降低MCAO小鼠脑梗死体积，改善脑水肿情况，减少脑缺血侧神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。其次，BCP可显著抑制脑缺血侧小胶质细胞活化，减少小胶质细胞来源的肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfator-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)的释放。最后，BCP抑制MCAO小鼠小胶质细胞M1型极化，促进M2型极化，从而改善MCAO小鼠神经炎症反应。
2.小鼠MCAO后6h，TLR4及MyD88蛋白水平均较sham组显著升高，MCAO后24h达到高峰，持续到MCAO后72h开始降低。MCAO后24h，BCP可剂量依赖性的降低TLR4、MyD88蛋白水平，减少缺血侧皮层Iba1+TLR4+及Iba1+MyD88+小胶质细胞数。与溶剂组比较，MCAO后6h及24h，BCP显著降低TLR4、MyD88蛋白水平；MCAO后72h，BCP下调TLR4蛋白水平，对MyD88蛋白水平无显著性影响。MCAO后24h，在sham组中BCP对磷酸化IκB-α(phosphorylatedIκB-α,p-IκB-α)，IκB-α及细胞核中磷酸化NF-κBP65(phosphorylated P65, p-P65)蛋白水平无显著性影响。与溶剂组相比，BCP显著降低p-IκB-α及p-P65蛋白水平，增加NF-κBP65抑制蛋白IκB-α蛋白水平。
3.BCP(0-50μM)各浓度均对原代小胶质细胞活性无显著性影响。该结果表明，BCP细胞毒性较低，安全性好。BCP可抑制LPS+IFN-γ激活的原小胶质细胞释放NO、TNF-α、IL-1β及IL-6，降低INOS蛋白水平，并可抑制原代小胶质细胞M1型极化，促进其M2型极化。BCP浓度依赖的降低LPS+IFN-γ刺激后原代小胶质细胞TLR4、MyD88蛋白水平的增加，同时降低活化原代小胶质细胞TLR4及MyD88免疫荧光强度。LPS+IFN-γ刺激后原代小胶质细胞内p-IκB-α、核内p-P65蛋白水平显著增加，IκB-α的蛋白水平显著下降，而BCP预处理改善p-IκB-α及核中p-P65蛋白水平的上调程度，恢复IκB-α蛋白水平。与LPS+IFN-γ单独处理的原代小胶质细胞培养基相比，BCP处理后的原代小胶质细胞条件培养基可减少原代神经元凋亡。
结论
1.BCP可能通过抑制MCAO后脑缺血侧神经细胞凋亡，小胶质细胞介导的神经炎症反应等改善MCAO小鼠神经功能缺损；
2.BCP可能通过对小胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的有力调控，抑制MCAO后小胶质细胞过度活化和M1型极化，促进M2型极化，从而减轻MCAO后神经炎症反应，进而减轻对神经元的损伤。