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目的：
脑卒中在世界范围内具有极高的死亡率和致残率。由于脑白质的特殊血供，脑卒中不仅引起灰质损伤，而且会引起深部白质损伤(White matter injury, WMI)。WMI会导致严重的神经行为障碍。β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)是一个双环倍半萜类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和保护神经的功能。关于BCP对脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIR)的影响的研究较多，但在CIR所致WMI中研究的较少，其作用机制尚不明确。
本实验拟在体内外建立脑缺血再灌注损伤模型，研究BCP对CIR导致的WMI的影响及其作用机制。
方法：
1.体内实验：实验分为两部分。第一部分：随机将C57BL/6小鼠分为正常对照组(Control)、模型组(CIR)、治疗组(36、72、144mg·kg-1)。线栓法建立小鼠MCAO模型。缺血1h再灌注24h，TTC染色确定脑梗死体积，并进行神经行为学评分，干湿重法测脑含水量，HE染色及透射电镜观察胼胝体损伤情况，LFB染色标记脑神经髓鞘，Westernblot测胼胝体MBP、NF、Bcl2、Bax和Caspase-3蛋白的表达。第二部分：随机将C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham)模型组(CIR)、治疗组(72mg·kg-1)、治疗组+抑制剂组(BCP+SKF)、抑制剂组(SKF)，预先连续给药5天，建立小鼠MCAO模型。再灌注24h后，用TTC染色检测梗死体积，并进行神经行为评分，HE染色和透射电镜观察胼胝体病理变化，LFB染色观察脑神经髓鞘损伤情况，Westernblot检测MBP、NF、TRPC6、CREB、p-CREB和BDNF的表达，采用水迷宫法(Morris water maze, MWM)对小鼠的空间学习记忆能力进行了评价。
2.体外实验：体外培养少突胶质前体细胞系(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)，将细胞随机分为5个组：Control组、OGD/R组、BCP+OGD/R组(BCP组)、BCP+SKF+OGD/R组(BCP+SKF组)、SKF+OGD/R组(SKF组)。待细胞长至80%以上，提前12h给予BCP处理，OGD/R前2h加入SKF处理。对OPCs氧糖剥夺2h后，复糖复氧24h建立OGD/R模型，采用MTT法检测细胞活力筛选最佳的给药浓度(1,5,10,20,25μM)和抑制剂浓度(1,5,10,20,25,40μM)，荧光定量PCR(qPCR)检测TRPC6、CREB和BDNFmRNA的表达，流式细胞术和JC-1法检测细胞凋亡，流式测定细胞内钙离子浓度，免疫荧光检测OPCs标志蛋白PDGFRα的表达，Westernblot法检测PDGFRα及TRPC6、p-CREB和BDNF通路蛋白的表达。
结果：
实验结果显示：1.与模型组相比，BCP降低CIR小鼠脑梗死体积，减轻神经功能缺损和脑水肿，CIR小鼠脑白质的病理学改变较轻，神经纤维排列紧密，胼胝体空泡面积明显较少；明显改善损伤后髓鞘着色明显变浅，厚度变薄，髓鞘板层疏松、剥脱，髓鞘板层断裂为小碎片或空泡，轴索内细胞器肿胀；上调了MBP、NF和Bcl2蛋白的表达水平，减少Bax和Caspase-3表达。实验结果显示72mg·kg-1为最佳剂量组。2.在WMW试验中，相对于CIR组，BCP预处理提高了CIR小鼠的空间学习和记忆能力，小鼠的逃离潜伏期变短，穿越平台的次数及在目标象限的距离增加；Westernblot结果显示TRPC6、p-CREB、BDNF相关通路蛋白的表达上调。然而，加入SKF预处理组，逆转了BCP的以上作用，与BCP的作用结果相反，其作用结果类似于CIR组。3.MTT结果显示，在细胞中BCP和SKF的最佳浓度分别为10μM和20μM；与OGD/R组相比，BCP组TRPC6、CREB和BDNFmRNA表达上升；OGD/R和SKF组，细胞的凋亡率和细胞内钙离子浓度均高于BCP组，线粒体膜电位低于BCP组；免疫荧光和Westernblot结果提示，BCP组OPCs标志蛋白PDGFRα的表达上调，而OGD/R和SKF组，该蛋白的表达均下调。
结论：
研究结果表明：BCP对脑缺血再灌注白质损伤具有保护作用，其作用机制涉及到Bax/Bcl2凋亡通路和TRPC6/CREB/BDNF相关通路。该研究对治疗脑缺血再灌注损伤的治疗具有重要意义
脑卒中在世界范围内具有极高的死亡率和致残率。由于脑白质的特殊血供，脑卒中不仅引起灰质损伤，而且会引起深部白质损伤(White matter injury, WMI)。WMI会导致严重的神经行为障碍。β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)是一个双环倍半萜类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和保护神经的功能。关于BCP对脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIR)的影响的研究较多，但在CIR所致WMI中研究的较少，其作用机制尚不明确。
本实验拟在体内外建立脑缺血再灌注损伤模型，研究BCP对CIR导致的WMI的影响及其作用机制。
方法：
1.体内实验：实验分为两部分。第一部分：随机将C57BL/6小鼠分为正常对照组(Control)、模型组(CIR)、治疗组(36、72、144mg·kg-1)。线栓法建立小鼠MCAO模型。缺血1h再灌注24h，TTC染色确定脑梗死体积，并进行神经行为学评分，干湿重法测脑含水量，HE染色及透射电镜观察胼胝体损伤情况，LFB染色标记脑神经髓鞘，Westernblot测胼胝体MBP、NF、Bcl2、Bax和Caspase-3蛋白的表达。第二部分：随机将C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham)模型组(CIR)、治疗组(72mg·kg-1)、治疗组+抑制剂组(BCP+SKF)、抑制剂组(SKF)，预先连续给药5天，建立小鼠MCAO模型。再灌注24h后，用TTC染色检测梗死体积，并进行神经行为评分，HE染色和透射电镜观察胼胝体病理变化，LFB染色观察脑神经髓鞘损伤情况，Westernblot检测MBP、NF、TRPC6、CREB、p-CREB和BDNF的表达，采用水迷宫法(Morris water maze, MWM)对小鼠的空间学习记忆能力进行了评价。
2.体外实验：体外培养少突胶质前体细胞系(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)，将细胞随机分为5个组：Control组、OGD/R组、BCP+OGD/R组(BCP组)、BCP+SKF+OGD/R组(BCP+SKF组)、SKF+OGD/R组(SKF组)。待细胞长至80%以上，提前12h给予BCP处理，OGD/R前2h加入SKF处理。对OPCs氧糖剥夺2h后，复糖复氧24h建立OGD/R模型，采用MTT法检测细胞活力筛选最佳的给药浓度(1,5,10,20,25μM)和抑制剂浓度(1,5,10,20,25,40μM)，荧光定量PCR(qPCR)检测TRPC6、CREB和BDNFmRNA的表达，流式细胞术和JC-1法检测细胞凋亡，流式测定细胞内钙离子浓度，免疫荧光检测OPCs标志蛋白PDGFRα的表达，Westernblot法检测PDGFRα及TRPC6、p-CREB和BDNF通路蛋白的表达。
结果：
实验结果显示：1.与模型组相比，BCP降低CIR小鼠脑梗死体积，减轻神经功能缺损和脑水肿，CIR小鼠脑白质的病理学改变较轻，神经纤维排列紧密，胼胝体空泡面积明显较少；明显改善损伤后髓鞘着色明显变浅，厚度变薄，髓鞘板层疏松、剥脱，髓鞘板层断裂为小碎片或空泡，轴索内细胞器肿胀；上调了MBP、NF和Bcl2蛋白的表达水平，减少Bax和Caspase-3表达。实验结果显示72mg·kg-1为最佳剂量组。2.在WMW试验中，相对于CIR组，BCP预处理提高了CIR小鼠的空间学习和记忆能力，小鼠的逃离潜伏期变短，穿越平台的次数及在目标象限的距离增加；Westernblot结果显示TRPC6、p-CREB、BDNF相关通路蛋白的表达上调。然而，加入SKF预处理组，逆转了BCP的以上作用，与BCP的作用结果相反，其作用结果类似于CIR组。3.MTT结果显示，在细胞中BCP和SKF的最佳浓度分别为10μM和20μM；与OGD/R组相比，BCP组TRPC6、CREB和BDNFmRNA表达上升；OGD/R和SKF组，细胞的凋亡率和细胞内钙离子浓度均高于BCP组，线粒体膜电位低于BCP组；免疫荧光和Westernblot结果提示，BCP组OPCs标志蛋白PDGFRα的表达上调，而OGD/R和SKF组，该蛋白的表达均下调。
结论：
研究结果表明：BCP对脑缺血再灌注白质损伤具有保护作用，其作用机制涉及到Bax/Bcl2凋亡通路和TRPC6/CREB/BDNF相关通路。该研究对治疗脑缺血再灌注损伤的治疗具有重要意义