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胎盘是妊娠期间母胎物质交换的重要器官,胎儿依靠胎盘从母体获取营养和气体,胎盘还可以合成多种激素、酶和细胞因子等维持正常妊娠。胎盘由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜三部分构成,其中叶状绒毛膜占胎盘组织的主要部分,它是由囊胚的滋养层发育而来。滋养细胞是构成绒毛膜的主要成分,随着妊娠的发展可分化为多种滋养细胞,如细胞滋养细胞、合体滋养细胞和绒毛外滋养细胞(EVTs)。细胞滋养细胞和合体滋养细胞统称为绒毛滋养细胞,他们分别形成绒毛的内层和外层,构成人类胎盘的基本运输单位,为胎儿运输营养物质。合体滋养细胞还分泌大量的激素,如人绒毛膜促性腺激素,对维持正常妊娠是必不可少的。绒毛外滋养细胞在胎盘的发育过程中可侵犯胎盘床的螺旋动脉,引起螺旋动脉重塑,维持胎盘的正常生理功能。大量研究表明,绒毛外滋养细胞侵袭异常可引起螺旋动脉重塑失败及胎盘浅着床,导致多种妊娠疾病的发生,如子痫前期和严重宫内胎儿生长受限等。Wnt信号传导通路是参与胎盘发育过程的保守通路之一。经典Wnt信号传导通路即Wnt/β-catenin,该通路的活化依赖胞外Wnt蛋白配体与其受体结合后,抑制胞内APC/Axin/GSK-3β/CK1α降解复合体形成,阻断β-catenin的降解途径,使β-catenin在胞质内累积,继而转位至细胞核与TCF/LEF转录因子家族结合并将TCF/LEF活化为转录激活蛋白。活化后的LEF-1/TCF可以调节多种靶蛋白的表达,继而发挥一系列生理功能。研究表明,Wnt信号传导通路可参与调控人类滋养细胞的多种生理过程,如滋养细胞的黏附,侵袭和分化。DKK1是一种分泌型糖蛋白,它与Wnt受体LRP5/6及另一类穿膜蛋白结合形成三聚体,诱导细胞内吞,减少细胞膜上LRP5/6的表达,从而阻断经典Wnt信号向胞内的传导,影响滋养细胞侵袭、迁移等。目前,Yao-Yu Chen等研究发现Htr Aa家族可参与细胞侵袭的调控,Htr A4(high temperature reguirement A4,Htr A4)是一种丝氨酸蛋白酶,它可以降解纤维连接蛋白,促进细胞的侵袭。Liang-Jie Wang等采用染色质免疫沉淀芯片分析技术证实Htr A4基因是GCM1的靶基因。GCM1(Glial cells missing 1)是胎盘形成过程中的一个重要转化因子,研究发现它可以通过调节胎盘生长因子(PGF)及合胞素的表达,促进胎盘血管的生成以及滋养细胞的融合,且Lu J等研究者发现GCM-1和Wnt信号传导通路成员Fzd5之间可能存在正反馈作用,共同调节绒毛分支的形成。然而,经典Wnt信号传导通路是否通过调节GCM-1/Htr A4的表达进而影响滋养细胞侵袭力目前尚未报道。本研究利用Wnt信号传导通路阻滞剂Dickkopf-1(DKK-1)处理人绒毛膜滋养细胞系JEG-3细胞和JAR细胞,探讨Wnt信号传导通路对滋养细胞中GCM-1/Htr A4的表达及细胞侵袭力的影响。目的研究采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和Transwell实验,分别检测人绒毛膜滋养细胞系JEG-3细胞和JAR细胞在DKK-1处理前后β-catenin、GCM-1、Htr A4 m RNA和蛋白的表达以及细胞侵袭力的改变。探讨Wnt信号传导通路对滋养细胞GCM-1/Htr A4的表达及细胞侵袭力的影响。材料和方法1研究对象本研究选用人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞和JAR细胞(购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司),在37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中,用含10%FBS、100U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM-H完全培养基进行培养,待细胞生长至对数生长期时进行后续试验。2方法本研究利用DMEM-H完全培养基(10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)将细胞悬浮,然后置于恒温培养箱中培养。根据细胞的生长曲线,待细胞生长至对数生长期时,将其消化并接种于6孔细胞培养板,每孔细胞浓度为1.5×106,接种完毕,将细胞培养板放入恒温培养箱孵育24 h。然后,将不同冻存批次的细胞分别进行配对分组:对照组和DKK-1(150ng/ml)处理组。将各组细胞放入恒温培养箱24h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,并进行后续检测。采用Transwell实验检测细胞处理前后侵袭力的变化。同时提取各组细胞的m RNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR实验(Real time-PCR)和蛋白免疫印迹实验(Western Blot)分别检测处理前后细胞中β-catenin、GCM-1、Htr A4 m RNA和蛋白表达水平。3统计学处理本研究采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析处理,数据均以?x±s的方式表示。当数据服从正态分布时采用配对设计定量资料的t检验,当数据不符合正态分布时采用配对设计定量资料的符号秩和检验,以α=0.05为检验水准。结果1 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞β-catenin、GCM1和Htr A4 m RNA的表达1.1 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞β-catenin m RNA的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中β-catenin m RNA的表达水平(0.45±0.15),与对照组(1.00±0.24)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中β-catenin m RNA的表达水平(0.52±0.18),与对照组(1.00±0.39)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.2 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞GCM1 m RNA的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中GCM1 m RNA的表达水平(0.66±0.22),与对照组(1.00±0.31)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中GCM1 m RNA的表达水平(0.74±0.25),与对照组(1.00±0.30)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。1.3 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞Htr A4 m RNA的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中Htr A4 m RNA的表达水平(0.45±0.29),与对照组(0.99±0.50)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中Htr A4 m RNA的表达水平(0.46±0.17),与对照组(1.00±0.50)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞β-catenin、GCM1和Htr A4蛋白的表达2.1 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞β-catenin蛋白的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中β-catenin蛋白的相对表达量(0.48±0.14),与对照组(0.89±0.14)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中β-catenin蛋白的相对表达量(0.65±0.11),与对照组(0.84±0.06)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞GCM1蛋白的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中GCM1蛋白的相对表达量(0.60±0.19),与对照组(0.78±0.16)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中GCM1蛋白的相对表达量(0.68±0.07),与对照组(0.79±0.14)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.3 Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞Htr A4蛋白的表达DKK1处理24h后,实验组JEG-3细胞中Htr A4蛋白的相对表达量(0.07±0.16),与对照组(0.15±0.08)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞中Htr A4蛋白的相对表达量(0.06±0.02),与对照组(0.17±0.02)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Wnt信号通路阻滞剂DKK1处理后滋养细胞侵袭力的改变经DKK-1干预36h后,实验组JEG-3细胞发生侵袭的细胞数(79.38±13.15),与对照组(102.40±17.35)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组JAR细胞发生侵袭的细胞数(96.22±11.89),与对照组(123.50±15.93)相比明显降低,经统计学处理,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Wnt信号传导通路可以促进滋养细胞中GCM-1和Htr A4的表达,增强滋养细胞的侵袭力。