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表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gaLllate，EGCG) 是绿茶提取物茶多酚的主要成分之一，具有强有力的抗氧化和抗炎作用，已经初步应用于帕金森病的神经保护治疗研究，旨在阻断或逆转黑质致密部多巴胺能神经元的慢性进行性变性过程。现已证明抗氧化和抗炎症反应是EGCG的两个重要神经保护机制，目前信号转导通路如PKC、ERK、P13K、NF-κ B通路也在EGCG的神经保护中发挥了重要的作用。STAT是与炎症密切相关的信号转导通路，广泛表达于不同类型细胞和组织的胞浆中，在神经系统的发育和神经细胞的存活和再生中起到了重要的作用。但STAT与EGCG神经保护作用的关系未明。
目的
建立稳定的6-OHDA神经毒性细胞模型，证实EGCG对多巴胺能神经细胞的保护作用，并进一步探讨6-OHDA和EGCG对STAT表达和活性的影响，从而在细胞分子水平阐明STAT信号转导通路在6-OHDA神经毒性和EGCG神经保护中的作用，为EGCG进一步应用于动物和临床治疗研究提供理论依据和实验支持，也为帕金森病神经保护药物的临床治疗研究提供一个新的作用靶点。
材料与方法
(1)细胞培养：将人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞采用DMEM高糖培养基(含100g/L胎牛血清，100U／mL青霉素和100U／mL链霉素)，置于37℃、体积分数5﹪CO2的恒温培养箱中培养。 (2)药物处理：待培养的细胞达对数生长期时，以1×10<4>个／孔的密度将细胞接种于96孔板，细胞培养24小时后用不同浓度的6-OHDA和／或EGCG处理细胞，实验分为对照组、药物处理组。6-OHDA浓度为50-400umol／L，EGCG浓度为0.01-400 umol／L。每个浓度设6个复孔，上述浓度均为终浓度。(3)细胞活力测定：药物处理24小时后用四甲基偶氮唑盐法(MTTassay)和<3>H标记胸腺嘧啶掺入实验(<3>H-TdR incorporation assay)检测细胞活力，MTT实验原理是通过测定活细胞胞浆内酶活性间接测定活细胞的数量，为了消除6-OHDA和EGcG在细胞培养基中的相互作用及药物本身对实验OD值的影响，我们进一步应用了<3>H-TdR细胞掺入实验，该方法较MTT实验在检测细胞增殖活性方面更加敏感。<3>H-TdR细胞掺入实验原理是利用测定细胞DNA合成的相对数量间接测定增殖细胞的相对数量，MTT和<3>H-TdR实验分别重复6次。 (4)细胞内STAT1及STAT3及其磷酸化形式表达的检测：通过前述实验我们确定了6-OHDA毒性作用的最适浓度(100umol/L)和EGCG神经保护作用的浓度范围(0.1-10 umol/L)，并据此建立了稳定的6-OHDA毒性细胞模型和EGCG神经保护细胞模型。在此基础上我们进一步应用western blot方法检测药物对多巴胺能神经细胞内STAT1、STAT3及其磷酸化形式表达的影响，阐明6-OHDA毒性和EGCG神经保护作用的信号转导机制．每个实验重复3次。结果(1)6-OHDA对细胞活性的影响：6-OHDA引起细胞活性下降，具有浓度和时间效应。50-400umol/L，6-OHDA处理细胞24小时后浓度依赖性的引起细胞活性下降，细胞生存率分别为对照组的8.1-81.9﹪，与对照组相比差异有统计学意义。不同浓度的6-OHDA处理细胞24、48、72小时后，6-OHDA各个浓度均时间依赖性的引起细胞活性下降。由于6-OHDA100umol/L处理细胞24小时后细胞生存率下降为对照组的50﹪左右，因此我们应用100umol/L 6-OHDA处理SH-SY5Y细胞，来进行EGCG的神经保护作用及机制的研究。
(2)EGCG对细胞活性的影响：预先应用EGCG(0.1-400umol/L)处理细胞1小时，再加入100umol/L6-OHDA共同处理细胞24小时，低浓度EGCG(0.1-10umol/L)引起细胞活性(生存率为对照组的54-75.4﹪)较6-OHDA单独作用组(生存率为对照组的45﹪)增加，EGCG在1umol/L时细胞活性最高(对照组的75.4﹪)，差异有统计学意义(P<0.01)．EGCG在20-400umol/L时浓度依赖性引起细胞活性下降(对照组的15.3-21.4﹪)，细胞活性明显低于6-OHDA单独作用组(P<0.01)。单独应用EGCG处理细胞24小时也产生了同样的低浓度保护高浓度毒性的作用结果。
(3)6-OHDA对细胞STAT1、STAT3及其磷酸化表达的影响：western Blot结果显示100umol/L 6-OHDA处理细胞不同时间后(O.5、1、2、3、4、24、48小时)细胞内STAT3磷酸化水平下降，且在2d时后下降明显，条带相对密度为0.603±0.002～0.358±0.013，与对照组相比P<0.01，差异有统计学意义。我们进一步用不同浓度的6-OHDA(50、100、200umol/L)处理细胞2小时发现6-OHDA浓度依赖性的引起STAT3磷酸化表达的下降，6-OHDA100、200umol/L时条带相对密度分别为0.83±0.026，0.81±0.021，与对照组相比P<0.05，差异有显著性。但结果显示6-OHDA对STAT3、STAT1和STAT1磷酸化表达无影响。
(4)EGCG对细胞STAT3及其磷酸化表达的影响：我们预先应用EGCG(0.1和1umol/L)处理细胞15分钟，然后加入100umol/L 6-OHDA再处理2小时后western blot结果显示，EGCG1umol/L预处理组STAT3(磷酸化条带相对密度为0.844.0.013)，较6-OHDA单独应用组(0.60±0.010)增加(P<0.01)。单独应用EGCG(0.1、1、umol/L)处理细胞2小时同样引起了STAT3磷酸化表达的增加。EGCG在1umol/L时蛋白条带相对密度是1.23±0.024，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。EGCG预处理和单独应用对STAT3、STAT1及STAT1磷酸化表达无影响。
结论
(1)6-OHDA对多巴胺能神经细胞有毒性作用。
(2)低浓度EGCG(0-1-10umoVL)对6-OHDA损伤多巴胺能神经细胞有保护作用。高浓度EGCG(20-400umol/L)有毒性作用，加重6-OHDA引起的细胞损伤。
(3)6-OHDA时间和浓度依赖性引起细胞STAT3磷酸化水平逐步下降。说明6-OHDA的神经毒性可能和抑制STAT3磷酸化表达相关，STAT3磷酸化水平的降低可能是6-OHDA引起多巴胺能神经细胞死亡的早期原因之一。
(4)预先应用低浓度EGCG明显恢复了6-OHDA所致的STAT3的活性的降低。另外，低浓度EGCG单独处理多巴胺能神经细胞也显著增加了STAT3磷酸化的水平，这就说明EGCG对抗6-OHDA的神经毒性作用可能依赖于STAT3的激活。总上所述，我们的研究首次研究了STAT3在6-OHDA神经毒性和EGCG神经保护中的作用，表明了STAT3在EGCG对帕金森病的神经保护中有重要的作用。STAT3也可能会成为帕金森病神经保护药物研究的新的靶点。