论文部分内容阅读
研究背景及意义肾移植是目前治疗终末期肾病最有效的方式。然而,肾移植术后往往会出现肾功能延迟恢复,甚至导致急性肾功能损伤,严重者引起肾功能的丧失。然而,导致移植肾功能急性损伤的因素较多,最为主要的因素是肾缺血再灌注损伤（Ischemiareperfusion injury,IRI）,也是造成早期肾移植失败的主要原因。如何预防肾缺血再灌注损伤,成为肾移植术后预防急性肾损伤的重要环节。由于肾移植术后血管脆性增大和高代谢状态导致对缺血再灌注损伤敏感性增加,可引起急性肾损伤、移植物延迟恢复和慢性移植物功能障碍等。因此,肾缺血再灌注损伤也是引起肾移植术后患者死亡的重要原因之一。缺血再灌注的病理生理学比较复杂,包括代谢的改变、氧化自由基、炎症因子、先天性因素和适应性免疫反应的激活以及伴随着微血管功能障碍的变化。目前预防肾脏免受缺血再灌注损伤主要采取药物、物理或手术预处理等方法,但最佳治疗方案仍未发现。衣康酸被认为一直在工业合成中发挥重要作用。最近研究发现它也是一种抗炎代谢物,可以在抗炎抗氧化中发挥重要作用。免疫应答基因1（Irg1）在巨噬细胞高表达,在抗炎过程中发挥着积极作用。Irg1可以调节编码顺乌头酸脱羧产生衣康酸酶相关基因,在哺乳动物和人类免疫细胞中Irg1表达水平与衣康酸的含量具有相关性。已经有研究发现Irg1通过调控衣康酸的合成在心肌缺血再灌注损伤和肝缺血再灌注损伤中发挥重要作用。Irg1是否可以通过调控衣康酸抑制肾缺血再灌注损伤目前仍未见研究报道。本研究主要通过两部分进行。第一部分,对肾移植术后患者各项指标进行分析,发现肾移植患者术后血清衣康酸浓度与其炎症状态及肾功能恢复均具有相关性;进一步通过构建小鼠缺血再灌注模型验证衣康酸对肾缺血再灌注损伤引起的氧化应激因子及炎症因子的变化。第二部分,深入探索Irg1通过衣康酸二甲酯激活Nrf2通路保护急性肾损伤的机制,发现Irg1调控衣康酸二甲酯在肾移植术后预防缺血再灌注引起的急性肾损伤的作用。第一部分衣康酸抑制肾缺血再灌注降低急性肾损伤的作用机制初步研究研究目的收集临沂市人民医院肾移植中心术后患者第10天的血液样本,并利用气相色谱串联质谱法检测衣康酸（Itaconic Acid,IA）浓度与肾移植术后肾功能相关指标及炎性因子之间的相关性。通过构建C57BL/6小鼠的肾缺血再灌注模型,探讨衣康酸对肾缺血再灌注损伤引起的氧化应激因子及相关炎症因子的变化。研究方法（1）选取2017年12月至2020年12月期间在临沂市人民医院器官移植中心行肾脏移植术后患者40例。收集患者术后第10天的血液样本,检测衣康酸浓度与血肌酐、尿素氮、TNF-α和IL-1 β之间的相关性。（2）将体重在23-25g之间的C57BL/6小鼠随机分成三个组:假手术组（Sham）、缺血再灌注损伤组（IR）和缺血再灌注损伤预先加入衣康酸组（IR+IA）,每组 20 只。（3）对缺血再灌注组的小鼠,夹闭双侧肾蒂缺血30分钟后行再恢复灌注。衣康酸处理组在夹闭肾蒂前2小时经腹腔给予衣康酸（剂量为500mg/只）注射,其他组小鼠则给予等体积生理盐水注射。（4）经过再灌注24小时后处死小鼠并留取下腔静脉血及肾脏组织标本。留取血液标本进行氧化应激因子检测,对肾组织行苏木精-伊红（HE）染色分析。（5）利用ELISA检测小鼠血清炎性因子的表达。研究结果（1）通过气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）检测发现,40例肾移植患者术后第10天血清衣康酸浓度与SCr、BUN、TNF-α及IL-1β表达之间均具有显著相关性。（2）与Sham组比较,IR组小鼠丙二醛（MDA）的表达明显升高,并且随灌注时间的延长逐渐升高,差异存在统计学意义。然而,IR+IA组与IR组相比,MDA表达水平却明显降低,差异也存在一定的统计学意义。（3）与Sham组比较,IR组和IR+IA组小鼠的谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值明显下降,存在统计学上的差异。IR+IA组与IR组比较GSH/GSSG值更高,差异也有统计学意义。同时发现与Sham组比较,IR组小鼠的超氧化物歧化酶活性（SOD）值也明显下降,IR+IA组小鼠的SOD值也出现下降,也存在统计学差异。IR+IA组相比IR组来说SOD值则较高,差异存在统计学意义。与Sham组比较,IR组和IR+IA组小鼠的过氧化氢酶活性值（CAT）均出现明显下降,具有统计学差异。IR+IA组与IR组比较CAT值则升高。（4）与Sham组相比较,IR组和IR+IA组小鼠血清中TNF-α、IL-1β及iNOS的表达均升高,但IR+IA组与IR组比较其均出现的下降趋势,在TNF-α和IL-1β中存在统计学差异。（5）HE染色结果显示,与Sham组相比较,IR组肾脏组织损伤更明显,而IR+IA组肾脏组织损害程度相对较轻,但仍可见部分损伤形态改变。研究结论本研究发现肾移植患者术后血清衣康酸浓度与其炎症状态及肾功能恢复均具有相关性。衣康酸处理后的肾缺血再灌注小鼠相关氧化应激指标均不同程度的升高,表明其可以通过激活氧化应激因子来降低对肾脏的损害。衣康酸处理后的肾缺血再灌注小鼠相关炎性因子指标下调,可能通过减轻全身的炎症反应,对肾脏起到抗炎保护作用。第二部分Irg1通过衣康酸二甲酯（DI）激活Nrf2通路保护急性肾损伤的机制研究研究目的探讨免疫应答基因1（Immune response genel,Irg1）通过衣康酸二甲酯（Dimethyl itaconate,DI）激活转录因子 2（Transcription factor nuclear factor-erythroid 2,Nrf2）通路向核内的转运来阻止巨噬细胞活化,对于缺血再灌注引起急性肾损伤的保护作用。研究方法（1）通过采用短暂夹闭双侧肾蒂20分钟或40分钟的方法进行小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型的构建。采取供体左肾切除后移植到受体进行构建肾脏移植小鼠模型。（2）从哺乳期小鼠的肾脏组织中获取鼠肾细胞,与RAW264.7细胞分别进行体外细胞培养。利用Western Blot和RT-PCR检测相关基因的表达差异。HE染色检测肾组织中肾小球及肾小管的损伤情况。（3）使用ELISA试剂盒分析血清和培养上清液中在不同处理条件下TNF-α和IL-1β的表达水平。利用化学试剂盒检测不同处理条件下血肌酐和尿素氮的变化情况。（4）采用质粒转染的方法进行基因敲除,将siRNA转染RAW264.7细胞和肾细胞,利用RT-PCR和Western Blot检测siRNA干扰后Irf1和Cebpβ基因的表达水平。研究结果（1）与Sham组比较,IR组小鼠缺血再灌注后0-36小时,外周血单核细胞（PBMC）和肾脏组织中Irg1的mRNA和蛋白质表达均上调,其中在PBMC中第12小时出现差异,而在肾脏组织中第6小时开始出现明显差异,且差异具有统计学意义。缺血30分钟再灌注0-36小时后血清TNF-α和IL-1β的表达持续上升,但到12小时开始出现下降趋势。（2）缺血再灌注后Irg1-/-小鼠比Irg1+/+小鼠的存活率显著下降（P=0.0004;Kaplan-Meier检验）,差异具有统计学意义。与Sham组相比,通过HE染色可以发现Irg1-/-小鼠的肾细胞缺血再灌注后肾小球细胞损伤严重。Irg1+/+与Irg1-/-小鼠缺血30分钟再灌注后12小时尿素氮水平出现统计学差异,血肌酐也于24小时出现统计学差异。Irg1+/+与Irg1-/-小鼠缺血30分钟再灌注后血清中TNF-α和IL-1β的表达均在12小时出现统计学差异。（3）Irg1+/+与Irg1-/-小鼠肾缺血再灌注后经DI治疗后均可延长术后生存时间。利用ELISA法检测发现经过DI治疗后引起TNF-α和IL-1 β的表达水平下调。（4）缺氧处理后经DI治疗乳酸脱氢酶（LDH）的表达显著下降,出现显著统计学差异。Western Blot检测到在缺氧状态下经过DI处理后可以显著降低Caspase-3的表达水平。Western Blot同样发现Nrf2通路及其下游分子HMOX1的表达均呈上升趋势。缺氧再复氧（H/R）处理后检测发现shRNA介导的Nrf2基因敲除后DI组的LDH的表达显著下降,差异具有统计学意义。（5）DI预处理的肾细胞在H/R状态下的培养上清中TNF-α和IL-1 β的两者的表达均下调,具有统计学差异。用DI处理的不含shNrf2的上清中TNF-α和IL-1β的表达也下调。Western Blot检测DI预处理巨噬细胞中的p-p38、p38、p-p65、p65、Erk、p-Erk、JNK和p-JNK基因表达发现,经过DI处理后相关基因的表达呈下降趋势。（6）siRNA干扰后与对照组（NC）相比,Irf1和Cebpβ的敲除导致Irg1mRNA水平降低,在RAW264.7细胞中silrf1-2转染效率最高,而在肾细胞中silrfl-1转染效率最高;在RAW264.7细胞和肾细胞中siCebpβ-1的转染效率均最高。H/R处理后在RAW264.7细胞中silrf1和siCebpβ转染组中Irg1mRNA水平降低,差异具有统计学意义;而在肾细胞中silrf1、siCebpβ和PDTC转染组中Irg1mRNA水平均降低,但仅在siCebpbβ组和PDTC处理组中差异具有统计学意义。研究结论本研究发现Irg1的表达与肾缺血再灌注损伤时炎症细胞因子的表达呈负相关,可以降低肾缺血再灌注损伤引起的炎症反应。DI处理后可明显提高Irg1+/+小鼠发生肾缺血再灌注损伤后的生存期,并可以减少肾脏缺血再灌注损伤和改善全身炎症反应。同时发现,DI可以通过促进Nrf2向细胞核的转运来阻止巨噬细胞活化从而保护肾细胞免受氧化应激。综上,本研究揭示了 DI和Irg1通过调控Nrf2通路在保护缺血再灌注引起急性肾损伤中的作用机制,为临床预防肾移植术后急性肾损伤的发生提供了新的治疗策略。