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研究背景严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是一种新型病毒,造成2019年新冠肺炎（COVID-19）的暴发,在全球范围内迅速传播,带来世界性的卫生系统挑战。这种新出现的高致病性病毒属于RNA包膜病毒,受体结合域与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）高度同源,可导致严重致死的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。日前,全球累计确诊新冠肺炎人数超过一亿七千万,死亡人数高达381万。我国已有多项研究针对新冠肺炎的临床特征和流行病学特征,进行了系统性阐述。目前文献表明,乳酸升高、淋巴细胞减少和D-二聚体升高等临床特征可能提示预后不良。另有研究表明,高龄（≥75岁）、多肺叶受累和胸腔积液,均与疾病严重程度成正相关。正确识别危重症患者的早期临床特征,能够尽早预防疾病进展,寻找最佳治疗策略。因此,针对重症和危重症患者的临床特征差异开展临床回顾性研究,探寻重症和危重症患者疾病进展甚至死亡的危险因素,有望帮助临床医生评估现有诊疗方案,对降低病死率和减轻社会恐慌具有重要意义。新冠肺炎暴发以来,大量患者达到临床治愈康复出院。截止2021年6月15日,中国累计已确诊新冠肺炎91492例,其中86369例患者治愈出院。根据国家卫健委发布的新冠肺炎出院标准,出院患者必须满足的条件包括:无临床症状,影像学改善,3天以上无发热以及相隔24小时两次逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试验呈阴性。前期研究发现,部分康复患者出院后,鼻咽拭子、粪便或痰液样本SARS-CoV-2核酸检测出现复阳性,即所谓的“复阳”现象（re-detectable positive,RP）。复阳患者是否会传播病毒并感染他人暂未可知,引发了公众对现有新冠肺炎出院标准的担忧。然而,早期研究对于新冠肺炎出院患者知之甚少,特别是缺乏有关康复患者传染性和健康状况的长期随访,对疫情防控工作的开展造成了影响。因此,亟需针对出院患者进行更多随访研究,回顾长期数据,评估患者康复后的临床特征,特别是抗体水平,期望为进一步完善出院标准、改进新冠肺炎恢复期的管理策略,提供重要的理论支持。SARS-CoV-2的高传染性和可能导致的严重临床结局,要求研究者对其生物学特性和病毒-宿主间的相互作用深入挖掘。表观遗传学修饰干预基因组稳定和细胞内稳态,从而能够参与多种疾病。在病毒感染中,表观遗传同样参与病理生理的调控和影响疾病的严重程度。有研究认为,RNA病毒,如冠状病毒,能够驱动基因甲基化水平异常从而抵御宿主免疫反应,促进病毒复制和感染能力。血管紧张素转换酶2（ACE2）是SARS-CoV-2进入细胞的受体,近期研究认为ACE2的DNA甲基化和翻译后组蛋白修饰是新冠防治的潜在靶点。在新冠肺炎患者中开展DNA甲基化水平差异的分析,有助于探寻影响疾病易感性和严重程度的关键因素,为新冠肺炎的防控及精准治疗提供新思路。研究目的本研究回顾了山东省新冠肺炎62例重症及危重症患者的临床特征和527例出院患者6个月的随访数据,后续开展14例新冠肺炎轻症和重症患者的全基因组甲基化芯片分析,旨在探究新冠肺炎的危险因素、出院患者康复期的特征以及与疾病发生有关的分子机制,期望为完善现有诊疗方案和管理方案、寻找潜在的生物标志物和治疗靶点,提供坚实的理论依据。研究方法1.山东省新冠肺炎重症及危重症患者的临床特征回顾性队列研究a)回顾性队列纳入于2020年1月20日至3月12日期间所有就诊于山东省新冠肺炎定点医院（包括山东省胸科医院等）的62例重症及危重症新冠肺炎住院患者（男35例,女27例）。疾病严重程度根据中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新冠肺炎诊疗指南》（5.0-8.0版）进行分类。b)通过电子医疗系统,收集所有患者的常规病历、护理记录、实验室检查、影像学检查和微生物学检查等。c)采用序贯器官衰竭估计评分（SOFA）和急性生理学及慢性健康状况评分系统（APACHEⅡ）对入组患者进行病情评估。d)使用SPSS软件进行统计分析。采用Mann Whitney U检验、卡方检验或Fisher’s精确检验,分析计算不同组间临床参数差异。对患者的年龄、基础疾病、淋巴细胞计数、APACHEⅡ评分和SOFA评分进行单因素和多因素Logistic回归分析。探寻与重症新冠肺炎患者病情进展相关的危险因素。2.山东省527例新冠肺炎出院患者长期随访特点分析a)研究纳入于2020年1月21日至2月16日期间山东省新冠定点医院收治的527例新冠肺炎出院患者（男294例,女233例）。复阳患者被定义为通过咽拭子、肛拭子、粪便或痰液样本核酸结果复检测阳性的出院患者。疾病严重程度根据《新冠肺炎诊疗指南》（5.0-8.0版）进行分级。b)回顾所有患者的诊疗记录,包括电子医疗系统中的患者基线数据、病历和影像学结果等。c)SARS-CoV-2的检测样本取自咽拭子、肛拭子、痰和粪便样本,检验人员按照《新冠肺炎实验室检测技术指南第2版》,使用ORF1ab/N基因核酸检测试剂盒进行PCR检测。d)使用SPSS软件统计分析。采用Mann-Whitney U检验、卡方检验或Fisher精确检验,计算新冠肺炎不同组间的临床参数差异。3.新冠肺炎全基因组甲基化分析及差异基因功能研究a)研究纳入2020年1月27日至2020年5月18日期间于山东省新冠定点医院确诊新冠肺炎的住院患者14例,其中轻症及重症患者各7例,以及健康对照组7例,采集出院前的血液样本。所有受试者均无血缘关系。疾病严重程度根据《新冠肺炎管理指南》（5.0-8.0版）进行分级。b)使用QIAamp血液DNA提取试剂盒从患者及健康对照的全血中提取基因组DNA。重亚硫酸氢盐转化修饰处理后获得gDNA,利用DNA甲基化芯片 IlluminaInfinium Methylation EPICBeadChip（850K 芯片）进行全基因组扫描。进一步筛选差异的甲基化位点。c)利用genomestudio软件从原始数据中提取信号值,使用甲基化模块对数据进行归一化、标准化处理,完成数据质量控制。d)分析差异甲基化位点。实验组的差异分数（Diffscore）＜-13或＞13,且满足Δβ＞0.17或＜-0.17,提示为差异甲基化位点。e)利用Rstudio软件对差异甲基化位点进行非监督下的层次聚类分析。f)韦恩（VENN）图分析进一步筛选SARS-CoV-2感染的标志基因。g)进行差异甲基化基因的功能富集（GO）和通路富集（KEGG）分析,阐明差异甲基化基因在生物过程、信号转导和免疫系统等方面的功能意义。P＜0.05被认为是显著富集。h)利用Cytoscape软件构建基于差异甲基化基因的相互作用网络,使用插件Cytohubba筛选出关键基因。i)在GEO数据库中检索新冠肺炎患者的数据,筛选差异mRNA,进行甲基化和转录组联合分析。adj.P.Value＜0.05被认为有统计学意义。研究结果1.山东省新冠肺炎重症及危重症患者的临床特征回顾性队列研究a)所有62例重症患者中,男性占56%,年龄中位数为56.5岁;30例进展为危重症,年龄中位数63.0岁;7例死亡。73%确诊患者有明确流行病学史。b)新冠肺炎最常见的临床症状是发热（97%）和咳嗽（71%）;15例（24%）患者首发症状非发热,起病至发热的中位时间为3天。c)30例（48%）新冠肺炎患者有基础疾病,其中最常见的是心血管疾病（高血压34%,冠心病5%）。d)重症患者与危重症患者的白细胞计数、血红蛋白、淋巴细胞计数、D-二聚体和降钙素原水平存在显著差异,淋巴细胞计数降低伴随着疾病进展。e)重症患者胸部影像学改变包括双肺受累（98%）,斑片状阴影（65%）、毛玻璃样阴影（63%）和实变（47%）等。f)APACHE Ⅱ评分和SOFA评分的中位数分别为8.0和3.0。ARDS是最常见的并发症,危重症患者通常预后不良。g)单因素回归分析显示,高龄、基础疾病、SOFA评分及APACHE Ⅱ评分高、入院时淋巴细胞计数＜109/L是病情进展的危险因素。多因素Logistic回归分析显示,入院时淋巴细胞计数＜109/L与新冠严重程度显著相关。2.山东省527例新冠肺炎出院患者长期随访特点分析a)在527名出院患者中,32例（6.1%）在随访中再次检测到SARS-CoV-2核酸阳性,其中1 1例和4例呼吸道样本阴性,但通过粪便样本和肛拭子样本得到阳性检测结果。b)青少年（＜18岁）相比于其他年龄组更容易出现复阳,并且出现复阳的时间跨度较短（平均8.8天[6.0-9.0天]）,而中年组则相反（平均17.5天[14.0-17.5 天]）。c)复阳组（RP组）和非复阳组（NRP组）的影像学特征改善相似。d)出院3个月和6个月后,抗体阴性率分别为16.2%和24.6%。出院6个月后抗体转阴的病例在青少年组中更为常见（40%）。3.新冠肺炎全基因组甲基化分析及差异基因功能研究a)共计检测到214、245和228个差异甲基化位点（重症和对照组、重症和轻症、轻症和对照组）,其中异常高甲基化位点分别为114个、126个和113个,异常低甲基化位点分别为100个、119个和1]5个。异常高甲基化位点显著分布在CpG岛岸,而异常低甲基化位点显著分布在CpG岛岸和岛架。b)聚类分析结果表明,不同严重程度的新冠肺炎患者和健康对照组之间DNA甲基化有显著差别。c)Venn交集分析筛选出35个潜在的SARS-CoV-2“标记”基因,包括位于启动子区域的 12 个基因（ATHL1、CHN2、CHST15、CPLX2、CRHR2、DCAKD、GNAI2、HECW1、HYAL1、MIR510、PDE11A 和 SMG6）。d)重症和轻症患者组的差异甲基化基因GO分析显示,基因功能主要集中在神经肽、IL-13、趋化因子分泌、T辅助细胞分化和肥大细胞脱颗粒等方面;KEGG通路分析涉及的显著通路包括:鞘磷脂信号通路、Hippo信号通路、磷脂酶D信号通路、肥厚型心肌病、催产素信号通路、扩张型心肌病、Ⅰ型糖尿病和5-羟色胺神经通路等。e)重症和轻症组患者组差异甲基化基因进行PPI网络分析,确定了 4个相互作用程度最高的关键基因（GNG7、GNAS、PRKCZ和PRKAG2）;甲基化和转录组联合分析发现重症患者中GNG7和GNAS表达下调,强调了GNG7和GNAS2在SARS-CoV-2感染过程中的重要性。结论1.新冠肺炎患者入院时淋巴细胞计数降低（＜109/L）是病情进展最关键的独立危险因素;高龄,基础疾病（高血压和冠心病）,D-二聚体升高,血红蛋白降低,SOFA评分和APACH评分高,同样是疾病进展的危险因素;血细胞计数和降钙素原水平对后期继发细菌感染有一定参考价值。2.新冠肺炎出院患者中,青少年患者复阳几率高、时间跨度短、抗体转阴率更高,可能增加再感染风险;通过粪便核酸检测可能比其他途径更易检测出复阳结果。3.不同严重程度新冠肺炎患者的全基因组甲基化水平存在显著异常。统计分析筛选出35个可能预测SARS-CoV-2感染的差异甲基化基因;重症和轻症组间的差异甲基化基因富集于多种途径,包括炎症和免疫激活等通路;PPI分析确定GNG7、GNAS、PRKCZ和PRKAG2为关键基因,联合转录组分析GNG7和GNAS在新冠肺炎的发展过程中发挥更重要的作用。