论文部分内容阅读
目的:全反式维甲酸(All-trans Retinoic acid，ATRA)是维生素A的活性代谢产物，在脊椎动物骨骼发育中发挥着重要作用。本研究旨在研究斑马鱼幼鱼发育过程中，维甲酸(Retinoic acid, RA)信号对糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松(Glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)模型的干预作用，并探讨ATRA对幼鱼骨骼形成、骨代谢平衡的调控作用机制。
方法:(1)将斑马鱼受精卵分别暴露于含2μM、4μM、6μMATRA的饲养水中，于受精后0-72小时(hours after fertilization，hpf)，观察并记录胚胎的孵化率;于受精后4-14天(days after fertilization，dpf)记录幼鱼的死亡率和畸形率，并以此确定后续实验适宜的ATRA浓度。(2)从4dpf开始，以不同浓度ATRA处理泼尼松龙骨质疏松模型幼鱼，持续作用5天，于9dpf收集幼鱼标本，采用茜素红染色法观察幼鱼骨骼结构，并检测幼鱼体内碱性磷酸酶(AKP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)活性;提取幼鱼总RNA，通过qPCR定量检测成骨和破骨相关标志基因Runx2a、Runx2b、SP7、CSF1a、RANKL和转录共激活因子RBM14的表达水平，同时采用整体胚胎原位杂交技术定位检测幼鱼体内Runx2a、RANKL和RBM14基因的表达情况。(3)通过向一胞期胚胎显微注射特异性针对RBM14小分子干扰物morpholino(MO)以敲低RBM14的表达水平，进而观察12-48hpf胚胎中RBM14表达水平下调对RA信号通路调控分子——RA受体以及上述成骨和破骨标志基因表达的影响。
结果:(1)高浓度的外源性ATRA可明显抑制胚胎的孵化率，增加胚胎畸形率和死亡率。(2)ATRA可显著逆转泼尼松龙诱导的茜素红染色面积和累积光密度降低及AKP酶活力下降，且该逆转作用具有一定的剂量依赖性。(3)qPCR结果显示，ATRA可促进成骨标志基因Runx2a和Runx2b的表达，但同时也上调了破骨标志基因CSF1a和RANKL的表达;原位杂交实验结果与qPCR结果一致。(4)ATRA抑制斑马鱼幼鱼中转录共激活因子RBM14表达水平，并可逆转泼尼松龙导致的RBM14水平上调;(5)MO敲低实验结果提示，RBM14对ATRA信号通路重要功能分子RAR受体各亚型的表达也存在负性调节作用;下调RBM14对成骨和破骨标志基因表达水平的影响与外源性ATRA所诱导的作用相似，同时促进成骨标志Runx2和破骨标志RANKL基因的表达。
结论:(1)ATRA通过上调成骨标志基因的表达而拮抗泼尼松龙所诱发的骨质疏松;(2)ATRA与转录共激活因子RBM14之间存在负性互作关系;(3)ATRA诱导的RBM14下调及引发的RBM14对促成骨基因Runx2表达的抑制减弱，介导了ATRA对糖皮质激素性骨质疏松的拮抗作用。
方法:(1)将斑马鱼受精卵分别暴露于含2μM、4μM、6μMATRA的饲养水中，于受精后0-72小时(hours after fertilization，hpf)，观察并记录胚胎的孵化率;于受精后4-14天(days after fertilization，dpf)记录幼鱼的死亡率和畸形率，并以此确定后续实验适宜的ATRA浓度。(2)从4dpf开始，以不同浓度ATRA处理泼尼松龙骨质疏松模型幼鱼，持续作用5天，于9dpf收集幼鱼标本，采用茜素红染色法观察幼鱼骨骼结构，并检测幼鱼体内碱性磷酸酶(AKP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)活性;提取幼鱼总RNA，通过qPCR定量检测成骨和破骨相关标志基因Runx2a、Runx2b、SP7、CSF1a、RANKL和转录共激活因子RBM14的表达水平，同时采用整体胚胎原位杂交技术定位检测幼鱼体内Runx2a、RANKL和RBM14基因的表达情况。(3)通过向一胞期胚胎显微注射特异性针对RBM14小分子干扰物morpholino(MO)以敲低RBM14的表达水平，进而观察12-48hpf胚胎中RBM14表达水平下调对RA信号通路调控分子——RA受体以及上述成骨和破骨标志基因表达的影响。
结果:(1)高浓度的外源性ATRA可明显抑制胚胎的孵化率，增加胚胎畸形率和死亡率。(2)ATRA可显著逆转泼尼松龙诱导的茜素红染色面积和累积光密度降低及AKP酶活力下降，且该逆转作用具有一定的剂量依赖性。(3)qPCR结果显示，ATRA可促进成骨标志基因Runx2a和Runx2b的表达，但同时也上调了破骨标志基因CSF1a和RANKL的表达;原位杂交实验结果与qPCR结果一致。(4)ATRA抑制斑马鱼幼鱼中转录共激活因子RBM14表达水平，并可逆转泼尼松龙导致的RBM14水平上调;(5)MO敲低实验结果提示，RBM14对ATRA信号通路重要功能分子RAR受体各亚型的表达也存在负性调节作用;下调RBM14对成骨和破骨标志基因表达水平的影响与外源性ATRA所诱导的作用相似，同时促进成骨标志Runx2和破骨标志RANKL基因的表达。
结论:(1)ATRA通过上调成骨标志基因的表达而拮抗泼尼松龙所诱发的骨质疏松;(2)ATRA与转录共激活因子RBM14之间存在负性互作关系;(3)ATRA诱导的RBM14下调及引发的RBM14对促成骨基因Runx2表达的抑制减弱，介导了ATRA对糖皮质激素性骨质疏松的拮抗作用。