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表面活性剂在食品工业，化妆品，石油工业和污水处理等各领域的应用令其成为工业生产中使用最多和推崇的化学品之一。然而，大多数化学合成的表面活性剂衍生自石油产品，大量的石油消耗已经导致资源枯竭和环境污染。因此，必须解决对生态友好，可生物降解和可再生的表面活性剂替代品开发的相关问题。近年来，生物表面活性剂因其良好的生物降解性和生物相容性，较低的毒性，热稳定性和在极端条件下的耐受性越来越受到人们的关注。槐糖脂是具有代表性的糖脂生物表面活性剂之一，凭借其独特性能，在环境保护，食品，医药，医疗保健等不同工业领域的应用得到重视。尤其是医药领域，槐糖脂对细菌，真菌和病毒均具有出色的抗微生物活性。
生物膜是微生物以群体方式存在的一种形式，是导致微生物产生抗药性及感染型疾病难以治疗的重要原因之一。已有报道表明槐糖脂具有破坏微生物生物膜的潜力。槐糖脂除了具有其他天然抗菌剂安全性高、广谱性好、长效的优点，同时又具有良好的耐稳定性，完全可以开发作为新型的天然抗菌产品应用在医药行业中抑制生物膜的形成。槐糖脂对于微生物的生物膜的抑制作用的强弱及如何影响生物膜的生理状态，以及根据槐糖脂对生物膜的作用特点，如何将槐糖脂开发为抗生物膜的药物，都需要进一步深入的研究。因此，利用槐糖脂对细菌形成的主要几类生物膜的抑制活性进行系统的研究，研发出有效的控制生物膜形成的材料和方法，具有极大的科学意义和临床现实意义。
本论文的主要研究内容和结果如下:
1.单一碳源产内酯型槐糖脂的发酵策略及C18:1DLSL的纯化制备
由于天然合成的槐糖脂由20多种不同结构的槐糖脂分子组成，而不同结构槐糖脂的纯度和所占比例都会影响其生物活性，不同的应用和功能需要特定的槐糖脂组分。因此，本工作拟对产槐糖脂菌株球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)探究其最佳培养条件并利用基因工程方法生产高生物活性的单一槐糖脂分子双乙酰化十八碳内酯型槐糖脂分子(C18:1 DLSL)。
以葡萄糖为单一碳源发酵生产槐糖脂，得到了内酯型槐糖脂比例较高的混合物，并利用制备型HPLC制备得到纯度为95％以上的单一组分槐糖脂分子C18:1DLSL。在以葡萄糖为单一碳源的情况下通过补料发酵的方法，在300mL摇瓶发酵过程中补加葡萄糖。在发酵第三天开始每天补料1％葡萄糖的情况下，内酯型槐糖脂产量比非补料发酵条件下提高近一倍。通过构建内酯化酶sble过表达菌株将内酯型槐糖脂产量由野生型菌株的1.79g/L提高到4.16g/L，提高了1.3倍。内酯型产量的提高能够降低分离纯化C18:1DLSL的成本，为研究C18:1DLSL的应用潜力提供了条件。
2.槐糖脂抗菌和抗生物膜活性的探究
目前，关于单一槐糖脂分子纯品的抗微生物活性研究较少，鉴于C18:1DLSL优异的生物活性，以两种常见致病菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象，探究高纯度C18:1DLSL和粗品内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性。
纯品C18:1DLSL和内酯型槐糖脂完全抑制浮游状态的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的浓度分别为15mg/L和1500mg/L。而对于浮游状态的革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌，不论是C18:1DLSL还是粗品内酯型槐糖脂均没有产生有效的抑制作用。另外，首次报道了纯品C18:1DLSL对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和对其成熟生物膜的驱散作用，并且发现C18:1DLSL对铜绿假单胞菌生物膜状态下的最小抑菌浓度低于浮游微状态下。当C18:1DLSL浓度为20mg/L时，对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的抑制率分别是89％和70％。而内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性与C18:1DLSL相比均较弱。通过扫描电镜观察，经过C18:1DLSL和内酯型槐糖脂处理后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌体数量明显减少且细胞变小，细菌形态发生明显改变，细胞破碎，不定型基质物的附着减少。
3.槐糖脂与锌离子的组合物在开发抗医疗导管中生物膜活性的初步研究
目前，利用微生物产生的槐糖脂生物表面活性剂与锌离子组合后用于开发抗医疗导管中生物膜活性的研究还未见报道。本工作旨在通过探究C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子组合后的协同抗菌和抗生物膜活性，研究和开发医疗导管中槐糖脂与锌离子组合材料的抗生物膜涂层。
研究结果表明，当C18:1DLSL在极低的浓度(12 mg/L)的情况下同时添加锌离子(40 mg/L)时就能够抑制80％以上的金黄色葡萄球菌生物膜，较C18:1DLSL和锌离子在相同浓度下单独作用时的20％和30％左右，作用明显增强。内酯型槐糖脂与锌离子组合作用下对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显同样大于相同浓度下的单独作用。表明C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子的组合物对于浮游状态和生物膜状态的金黄色葡萄球菌均表现出协同抑制作用。对于铜绿假单胞菌成熟生物膜，当C18:1DLSL和锌离子浓度均为100mg/L时，驱散率达70％，比它们分别单独作用时40％和2％的驱散率有明显的提高。同样，内酯型槐糖脂与锌离子组合时的驱散作用较它们在相同浓度下单独作用时有明显增强。表明C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子的组合物对于铜绿假单胞菌成熟生物膜均表现出协同驱散作用。通过扫描电镜观察发现，经过C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子组合物处理后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的细胞均受损严重，形成的生物膜被严重破坏。以上结果表明槐糖脂和锌离子的组合物在抗细菌生物膜方面具有极大的应用潜力。
生物膜是微生物以群体方式存在的一种形式，是导致微生物产生抗药性及感染型疾病难以治疗的重要原因之一。已有报道表明槐糖脂具有破坏微生物生物膜的潜力。槐糖脂除了具有其他天然抗菌剂安全性高、广谱性好、长效的优点，同时又具有良好的耐稳定性，完全可以开发作为新型的天然抗菌产品应用在医药行业中抑制生物膜的形成。槐糖脂对于微生物的生物膜的抑制作用的强弱及如何影响生物膜的生理状态，以及根据槐糖脂对生物膜的作用特点，如何将槐糖脂开发为抗生物膜的药物，都需要进一步深入的研究。因此，利用槐糖脂对细菌形成的主要几类生物膜的抑制活性进行系统的研究，研发出有效的控制生物膜形成的材料和方法，具有极大的科学意义和临床现实意义。
本论文的主要研究内容和结果如下:
1.单一碳源产内酯型槐糖脂的发酵策略及C18:1DLSL的纯化制备
由于天然合成的槐糖脂由20多种不同结构的槐糖脂分子组成，而不同结构槐糖脂的纯度和所占比例都会影响其生物活性，不同的应用和功能需要特定的槐糖脂组分。因此，本工作拟对产槐糖脂菌株球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)探究其最佳培养条件并利用基因工程方法生产高生物活性的单一槐糖脂分子双乙酰化十八碳内酯型槐糖脂分子(C18:1 DLSL)。
以葡萄糖为单一碳源发酵生产槐糖脂，得到了内酯型槐糖脂比例较高的混合物，并利用制备型HPLC制备得到纯度为95％以上的单一组分槐糖脂分子C18:1DLSL。在以葡萄糖为单一碳源的情况下通过补料发酵的方法，在300mL摇瓶发酵过程中补加葡萄糖。在发酵第三天开始每天补料1％葡萄糖的情况下，内酯型槐糖脂产量比非补料发酵条件下提高近一倍。通过构建内酯化酶sble过表达菌株将内酯型槐糖脂产量由野生型菌株的1.79g/L提高到4.16g/L，提高了1.3倍。内酯型产量的提高能够降低分离纯化C18:1DLSL的成本，为研究C18:1DLSL的应用潜力提供了条件。
2.槐糖脂抗菌和抗生物膜活性的探究
目前，关于单一槐糖脂分子纯品的抗微生物活性研究较少，鉴于C18:1DLSL优异的生物活性，以两种常见致病菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象，探究高纯度C18:1DLSL和粗品内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性。
纯品C18:1DLSL和内酯型槐糖脂完全抑制浮游状态的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的浓度分别为15mg/L和1500mg/L。而对于浮游状态的革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌，不论是C18:1DLSL还是粗品内酯型槐糖脂均没有产生有效的抑制作用。另外，首次报道了纯品C18:1DLSL对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和对其成熟生物膜的驱散作用，并且发现C18:1DLSL对铜绿假单胞菌生物膜状态下的最小抑菌浓度低于浮游微状态下。当C18:1DLSL浓度为20mg/L时，对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的抑制率分别是89％和70％。而内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性与C18:1DLSL相比均较弱。通过扫描电镜观察，经过C18:1DLSL和内酯型槐糖脂处理后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌体数量明显减少且细胞变小，细菌形态发生明显改变，细胞破碎，不定型基质物的附着减少。
3.槐糖脂与锌离子的组合物在开发抗医疗导管中生物膜活性的初步研究
目前，利用微生物产生的槐糖脂生物表面活性剂与锌离子组合后用于开发抗医疗导管中生物膜活性的研究还未见报道。本工作旨在通过探究C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子组合后的协同抗菌和抗生物膜活性，研究和开发医疗导管中槐糖脂与锌离子组合材料的抗生物膜涂层。
研究结果表明，当C18:1DLSL在极低的浓度(12 mg/L)的情况下同时添加锌离子(40 mg/L)时就能够抑制80％以上的金黄色葡萄球菌生物膜，较C18:1DLSL和锌离子在相同浓度下单独作用时的20％和30％左右，作用明显增强。内酯型槐糖脂与锌离子组合作用下对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显同样大于相同浓度下的单独作用。表明C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子的组合物对于浮游状态和生物膜状态的金黄色葡萄球菌均表现出协同抑制作用。对于铜绿假单胞菌成熟生物膜，当C18:1DLSL和锌离子浓度均为100mg/L时，驱散率达70％，比它们分别单独作用时40％和2％的驱散率有明显的提高。同样，内酯型槐糖脂与锌离子组合时的驱散作用较它们在相同浓度下单独作用时有明显增强。表明C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子的组合物对于铜绿假单胞菌成熟生物膜均表现出协同驱散作用。通过扫描电镜观察发现，经过C18:1DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子组合物处理后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的细胞均受损严重，形成的生物膜被严重破坏。以上结果表明槐糖脂和锌离子的组合物在抗细菌生物膜方面具有极大的应用潜力。